一种辣椒根RNA提取方法技术

本发明专利技术涉及一种辣椒根RNA提取方法，属生物技术领域。本发明专利技术所解决的技术问题是提供了一种成本较低、效率较高的辣椒根RNA提取方法。本发明专利技术提取的辣椒根RNA的方法包括如下步骤：称取0.1g辣椒根，研磨后加入预热的裂解液和β-巯基乙醇，涡旋后水浴，加氯仿/异戊醇(24/1)离心，取上清加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)后再离心，加入沉淀剂沉淀后离心，乙醇洗涤并回收RNA。本发明专利技术操作简单，节约成本，能够很好的提取辣椒根RNA。

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒根RNA提取方法
:本专利技术涉及一种辣椒根RNA提取方法，属于生物
。
技术介绍
:辣椒(Capsicum annuum L.)俗称“辣子”,是全世界消费量最大的蔬菜之一,我国是居全球之首的辣椒生产和消费大国，辣椒在近几十年其贸易量超过咖啡与茶叶。据不完全统计，全国辣椒播种面积已超过140多万公顷，产量2700万吨，实现产值270亿元，占据我国蔬菜作物种植面积的1/10之多。随着种植及消费变化，辣椒育种方向和目的不再单纯以追求产量、早熟要求为目标，而逐步转向优质、抗病、抗逆和适应特殊要求，诸如适宜保护地栽培耐低温、耐弱光、高产品种，适宜加工的加工型辣(甜)椒等。而选育抗逆、优质、抗病品种的首要关键是选育具备目标特性的辣椒种质资源，因此通过现代生物技术及育种手段，探索特异资源的遗传机理、选育理想的辣椒种质资源亲本材料，显得尤为重要和迫切。目前对于辣椒的分子生物学研究正在深入，而RNA提取是分子生物学研究的基础，所以摸索一套适合辣椒根的RNA提取技术显的尤为重要。因为辣椒根中含有大量多糖和多酚，常规方法如Tr i Z01、改良Tr i z ο I等提取到的RNA质量不能满足试验要求，对辣椒的研究增加了困难。
技术实现思路
:针对目前的现状及存在的问题，本专利技术所要解决的问题是提供一种成本较低、效率较高的辣椒根RNA提取方法，能够提取到高质量的RNA，为后续试验提供了良好的基础。本专利技术提取辣椒根的方法包括如下步骤:一种辣椒根RNA提取方法，包括如下步骤:(I)取2ml离心管，加CTAB提取液lml，在65 - 70°C水浴中预热1min ；(2)液氮中研磨0.1g辣椒根；(3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β -巯基乙醇，裂解完毕后重新装入离心管，激烈涡旋30s，然后放回65 - 70°C继续水浴；(4)向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液并涡旋混合，在lOOOOrpm，4°C离心15min ；(5)将上清液转移至一新的离心管，重复抽提一次；(6)继续将上清液转移至另一新离心管中，再加入异丙醇，在4°C下沉淀2h;(7)然后在4°C，12000rpm条件下离心20 - 30min，振荡混匀分层后，再室温静置5~1min,弃上清液，用500 μ L70%乙醇洗沉淀,继续在4°C, 12000rpm条件下离心5min,然后再用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀I~2次；(8)弃上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。优选地，所述的CTAB提取液的组成成分为100mmol/L Tris - HCl、20mmol/LEDTA - Na2、l.4mol/L NaCl、2% CTABU % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 值为 8.0。优选地，步骤(3)中所述的β -巯基乙醇的加入量为30 μ L，水浴温度为65 -70°C，时间为4 - 5min。优选地，步骤(4)中所述的氯仿/异戊醇的体积比为24:1。优选地，步骤(6)中所述异丙醇的加入体积为上清液体积的1/3。【附图说明】图1为不用RNA提取方法的琼脂糖凝胶电泳比较结果图。A为Trizol法，B为改良Trizol法，C为本专利技术。【具体实施方式】:下面对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。一种辣椒根RNA提取方法，包括以下具体步骤:试剂准备1.2 X CTAB 提取缓冲液:100mmol/l Tris - HCl (ρΗ8.0)，20mmol/l EDTA - Na2,1.4mol/l NaCl,2% CTAB(ff/V) ,1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)。即:配置 100ml2XCTAB提取缓冲液需加=Trisl.2114g，EDTANa2.2Η200.7444g，NaC18.1816g，PVPlg，加水 60ml，用4MHC1调pH至8.0，定容至1 00ml，加入CTAB2g，65°C水浴溶解。以上试剂均用RNase Free水配置，122。。灭菌20min ;氯仿/异戊醇为24:1(V/V)。2.具体操作步骤(I)取2ml离心管，加CTAB提取液1ml，65 - 70°C水浴中预热lOmin。(2)液氮中研磨0.1g辣椒根。(3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β -巯基乙醇30 μ L，融化后重新装入离心管，激烈涡旋30s，放回65 - 70°C水浴。(4)加入等体积的氯仿/异戍醇并润旋混合，lOOOOrpm, 4°C离心15min。(5)将上清转移至一新。重复抽提一次。(6)将上清转移至一新离心管中，加入1/3上清体积冰冷的异丙醇，4°C下沉淀2h。(7) 4 V，12000rpm 离心 20 - 30min,弃上清，用 500 μ L70 % 乙醇洗沉淀，4 °C，12000rpm离心5min,然后用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀。(8)弃上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。3.Trizol法提取辣椒根RNA(I)称取约0.1g辣椒根，在液氮环境下研磨成灰白色粉末后，加入ImL Trizol裂解液。(2)室温放置5min，待融化后迅速转至1.5mL离心管中，使核酸蛋白复合物完全分离。(3)4°C，12000rpm，离心10min，样品分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中。取上清(约500 μ L)，转入另一干净的1.5mL离心管中。(4)加入200 μ L氯仿，盖好管盖，涡旋混匀15s，室温放置2min。(5)4。。, 12000rpm,离心1min,取上清(约600 μ L)，转入1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，涡旋混匀15s。(6) 4°C, 12000rpm,离心10min。取上清(约400 μ L),转入1.5mL离心管中，加入等体积冰的异丙醇，润旋混匀15s,室温放置lOmin。(7) 4°C, 12000rpm,离心1min (此时可能会出现沉淀)。弃上清，加入111^75%乙醇，震荡片刻。(8) 4°C, 7500rpm,离心5min。弃上清，4°C, 7500rpm,高速离心Imin,用移液器移走残余溶液，室温倒置lOmin。(9)加入 30 μ L RNase - free 水溶解 RNA。4.改良Trizol法提取辣椒根RNA(I)取1.5mL离心管，加入ImL Trizol裂解液、30 μ L β -巯基乙醇、30mg PVP,混匀，65 °C 水浴 15min。(2)称取0.1g辣椒根,在液氮条件下研成灰白色粉末后,迅速转入Trizol裂解液的离心管中，涡旋混匀。(3)65°C水浴15min，使核酸蛋白复合物完全分离，4°C，12000rpm，离心10min。其余步骤同Trizol试剂法。试验结果如图1和表1所示。表1不同RNA提取方法的RNA浓度和纯度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辣椒根RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取2ml离心管，加CTAB提取液1ml，在65‐70℃水浴中预热10min；(2)液氮中研磨0.1g辣椒根；(3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β‐巯基乙醇，裂解完毕后重新装入离心管，激烈涡旋30s，然后放回65‐70℃继续水浴；(4)向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液并涡旋混合，在10000rpm，4℃离心15min；(5)将上清液转移至一新的离心管，重复抽提一次；(6)继续将上清液转移至另一新离心管中，再加入异丙醇，在4℃下沉淀2h；(7)然后在4℃，12000rpm条件下离心20‐30min，振荡混匀分层后，再室温静置5～10min，弃上清液，用500μL70％乙醇洗沉淀，继续在4℃，12000rpm条件下离心5min，然后再用500μL100％乙醇洗沉淀1～2次；(8)弃上清，吹干后用30μLDEPC水溶解RNA。

【技术特征摘要】
1.一种辣椒根RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取2ml离心管，加CTAB提取液1ml，在65- 70°C水浴中预热1min ； (2)液氮中研磨0.1g辣椒根； (3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β-巯基乙醇，裂解完毕后重新装入离心管，激烈涡旋30s，然后放回65 - 70°C继续水浴； (4)向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液并涡旋混合，在10000rpm，4°C离心15min ； (5)将上清液转移至一新的离心管，重复抽提一次； (6)继续将上清液转移至另一新离心管中，再加入异丙醇，在4°C下沉淀2h； (7)然后在4°C，12000rpm条件下离心20- 30min,振荡混匀分层后，再室温静置5~1min,弃上清液,用500 μ 170%乙醇洗沉淀,继续在4°C, 1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国胜，马志虎，潘跃平，戴忠良，毛忠良，孙春青，吴国平，王建华，潘永飞，张振超，秦文斌，姚悦梅，
申请(专利权)人：镇江瑞繁农艺有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32