本发明专利技术公开了从普通小麦品种中国春中分离到的三个Waxy蛋白亚基编码基因的全长编码序列，对应的编码序列与其编码的蛋白亚基的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1-SEQ ID NO6所示。相应的，本发明专利技术公开了上述编码序列的克隆和体外表达方法；最后，本发明专利技术还公开了所述蛋白亚基在提高面粉品质中的应用。
【技术实现步骤摘要】
小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基和其编码基因及应用
本专利技术涉及一种小麦蛋白的表达及其应用，属于生物
。
技术介绍
普通小麦籽粒胚乳中含有分子量分别为62.8kD、56.7kD和58.7kD3种Waxy蛋白亚基，即 Wx-AUWx-Bl 和 Wx-Dl，由位于 7AS、4AL 和 7DS 的基因 Wx-7A、Wx_4A 和 Wx_7D 编码(Ainsworth和Clark，1993)。普通小麦品种，如中国春至今都未能分离到完整且准确的编码序列。由于小麦籽粒直链淀粉含量与Waxy蛋白的含量高度正相关(姚大年，1999)，直链淀粉含量是影响面条品质的重要因素，本领域多年来均集中于研究Waxy蛋白通过对直链淀粉含量等性状的影响，对于Waxy蛋白对品质的贡献率影响尚无研究。Waxy蛋白含有13个半胱氨酸残基，不能配对的单独残基可能参与了高低分子量谷蛋白骨架的形成，半胱氨酸残基是构成蛋白质分子内和分子间二硫键的结构基础(徐国恒，2010)，二硫键数目及位置会影响到面团的黏弹性，而黏弹性是影响小麦加工品质的重要因素(魏慧等，2012)。因此，对Waxy蛋白的二硫键等分子特性深入研究将对小麦品质改良及对淀粉性状及面条 品质改良具有重要意义。目前，本领域已经有研究体外微量掺入高分子量谷蛋白亚基配粉功能检测的方法，通过将基础面粉从35g、10g、5g和2g等不同规模进行配粉揉混分析试验，对一些亚基进行了体外功能鉴定。迄今为止,关于中国春Waxy编码基因的体外表达、Waxy表达蛋白的纯化以及该蛋白对面团品质效应的研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术公开了小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基和其编码基因及应用，通过使用E.coli体外表达系统，对分离自小麦品种中国春的三个完整Waxy编码序列进行表达获得目的蛋白亚基，再通过氧化-还原反应将纯化的蛋白整合到基础面粉中，从而提高了小麦加工产物的品质，为小麦品种中国春的基因遗传改良提供依据。为实现上述目的，本专利技术是通过下述技术方案实现的:首先，本专利技术公开了三种来源自中国春这-小麦品种的Waxy蛋白亚基，均从同样的普通小麦品种-中国春中获得，三种蛋白亚基的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分别为氨基酸序列为SEQ ID NOl ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N02 ;氨基酸序列为SEQ ID N03 ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N04 ;氨基酸序列为SEQ ID N05 ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N06。在上述基础上，本专利技术公开了所述小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基编码基因的克隆方法，是以中国春的cDNA为模版，采用下述引物进行PCR克隆:上游引物5，-ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3，；下游引物5 ’ -TCAGGGAGCG GCGACGTT-3 ’。其中，所述中国春cDNA既可以由试剂公司进行合成，也可自行采用中国春小麦籽粒粉碎后提取总RNA并相应合成cDNA。目前在市场上有多种在售的试剂盒来实现上述操作的快捷简化和高效准确。上述的PCR克隆采用本领域常规的PCR体系和条件即可。在完成上述克隆后，对所得PCR产物进行回收以获得纯化的目的片段，通常回收和纯化操作采用DNA纯化回收试剂盒进行，以提高成功率。具体的操作参考试剂盒的说明书即可。通过利用引物扩增小麦品种中国春的cDNA，将获得的目的片段经回收连接和转化，测序后得到3个序列，分别为Wx-Al、Wx-BU Wx-Dl，每个序列包含一个完整的编码区基因，分别编码下述三种蛋白亚基:Waxy-A蛋白亚基，Waxy-B蛋白亚基和Waxy-D蛋白亚基(以下简称为 Waxy-A, Waxy-B 和 Waxy-D)。基于上述获得的纯化的目的片段，本专利技术还公开了所述小麦品种中国春Waxy蛋白亚基的表达方法,包括构建重组表达质粒和重组质粒进行诱导表达的步骤,从而高效表达所需蛋白。具体的，构建重 组表达质粒包括如下步骤:将上述获得的目的片段用表达载体连接，然后连接产物转化入感受态细胞，在涂有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。作为优选的技术方案，所述表达载体为pEASY-Fl，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5a。作为本领域常用的其它表达载体，也是本领域技术人员可以理解的，例如表达载体可以为pET_28a。上述的感受态细胞既可以从试剂公司购买，市面上有多家生物试剂公司均销售感受态细胞成品，也可在实验室自行制备，通常是采用常规的CaC12方法制备E.coli DH5 α感受态细胞，具体的操作为本领域广泛所知，此处不予赘述。其中，重组质粒的诱导表达包括如下步骤:将筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达Waxy蛋白亚基的菌株，扩大培养细胞及诱导表达，通过纯化获得重组蛋白。其中，所述表达宿主细胞为E.coli BL21，为了保证最优的表达能力，优选为E.coli Rosettagami B(DE3)。作为本领域常用的其它表达宿主，也是本领域技术人员可以理解的，例如Rosetta-gami B> Rosetta-gami B (DE3) pLysS、Rosetta-gami B (DE3) pLacI2 等。在上述表达后,还包括对重组蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析的步骤,从而确保重组蛋白的表达效果。其中，所用的纯化步骤采用本领域常用方法，作为一种优选的技术方案，所述纯化包括以下步骤:取离心收集菌体加入破碎缓冲液，超声破碎，离心取沉淀，加入平衡缓冲液搅拌溶解，将离心的上清液过His-Trap HP蛋白纯化凝胶柱，用平衡缓冲液平衡，用平衡缓冲液、洗脱缓冲液洗涤，收集洗脱液，透析后低温冷冻干燥保存待用。最后，本专利技术深入研究了上述蛋白的功能，对纯化蛋白进行微量掺粉试验，发现本专利技术的Waxy蛋白三个亚基均对小麦加工品质具有显著的正向效应，因此本专利技术还公开了中国春小麦的Waxy蛋白亚基在提闻面粉品质中的应用。通过上述改进，本专利技术实现了如下效果；I，成功分离到三个Waxy基因的全长编码序列；2，成功实现了小麦品种中国春的三个Waxy基因进行体外表达、纯化、测序；3,成功发现了小麦品种中国春籽粒中的三个Waxy蛋白亚基对小麦加工品质的促进效应，有利于小麦加工品质的改良、品质的分子育种、种质资源的发掘与利用。【附图说明】图1为小麦品种中国春cDNA的PCR产物电泳分析结果，其中M为DNA MarkerDL2000 ；1 为 Wx-Al 产物；2 为 Wx-Bl 产物；3 为 Wx-Dl 产物；图2为三种编码序列进行E.col1.诱导表达产物的SDS-PAGE检测结果，其中M为蛋白marker ;箭头指向I为Waxy-A表达产物；2为Waxy-A阴性对照；3为Waxy-B表达产物；4为Waxy-B阴性对照；5为Waxy-D表达产物；6为Waxy-D阴性对照；图3为表达产物的Western blot分析,其中M为蛋白分子量Marker ;从I到3依次为Waxy-A蛋白亚基，Waxy-B蛋白亚基和Waxy-D蛋白亚基；图4为纯化产物的SDS-PAGE检测结果，其中M为蛋白分子量Marker ；1为诱导表达产物未纯化样品；从2到4分别为Waxy-A，Waxy-B和Wa本文档来自技高网...
【技术保护点】
小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO1；其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO2。
【技术特征摘要】
1.小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基，其特征在于氨基酸序列为SEQID NOl ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N02。2.小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基，其特征在于氨基酸序列为SEQID N03 ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N04。3.小麦品种中国春的Waxy蛋白亚基，其特征在于氨基酸序列为SEQID N05 ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N06。4.小麦品种中国春Waxy蛋白亚基编码基因的克隆方法，其特征在于小麦品种中国春小麦的cDNA为模版，采用下述引物进行PCR克隆: 上游引物 5 ’ -ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3，； 下游引物 5’ -TCAGGGAGCGGCGACGTT-3’。5.小麦品种中国春Waxy蛋白亚基的表达方法，其特征在于包括构建重组表...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈其皎，高翔，孟敏，董剑，赵万春，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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