本发明专利技术涉及在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法。描述了在巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性，不展现对于N-聚糖或O-聚糖的选自β-甘露糖基转移酶1活性和β-甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子；在培养基中生长所述宿主细胞；和从所述培养基中回收所述重组糖蛋白。
【技术实现步骤摘要】
生产成熟的人促红细胞生成素的方法以及包含获自该方法的人促红细胞生成素的组合物本申请是申请日为2010年10月11日的中国专利申请201080057790.7 “在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法”的分案申请。
本专利技术涉及在巴斯德毕赤氏酵母GcYcAia中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本专利技术涉及使用重组的巴斯德毕赤氏酵母菌株，其不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自由对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶1、3和4的活性构成的组的至少一种活性。这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以产生蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的α-甘露糖苷酶抗性的β-甘露糖残基。本专利技术进一步涉及在巴斯德毕赤氏酵母GcYcAia pastor is)中生产双唾液酸化的人促红细胞生成素的方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性。
技术介绍
生产重组的人蛋白质的能力引起了人体健康护理领域的很大发展，仍然是药物开发的活跃领域。许多治疗蛋白质需要向蛋白质的特定天冬酰胺残基翻译后添加聚糖GV-糖基化)以确保适当的结构-功能活性和随后在人血清中的稳定性。对于在人类中的治疗用途，糖蛋白需要人类样的糖基化。可以模拟人类样糖蛋白加工的哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞、人类视网膜细胞)具有几个缺点，包括低的蛋白质滴度、长发酵时间、异源产物、以及持续的病毒防范。因而希望的是使用不仅在短发酵时间中产生高的蛋白质滴度、而且还产生人类样糖蛋白的表达系统。真菌宿主例如甲基营养型酵母巴斯德毕赤氏酵母具有用于治疗蛋白质表达的独特优点，例如，它们不分泌高量的内源蛋白质，生产异源蛋白质的可诱导的强启动子是可用的，它们可以在化学成分已知的培养基中生长并且不使用动物血清，它们可以生产高滴度的重组蛋白质(Creggei a7.，FEMS Microb1l.Rev.24: 45-66 (2000))。然而，在巴斯德毕赤氏酵母中表达的糖基化蛋白质一般含有额外的甘露糖糖类，产生“高甘露糖”的聚糖，以及在糖蛋白上赋予负电荷的甘露糖基憐酸基团。具有闻甘露糖聚糖或具有带电甘露聚糖的糖蛋白存在着在人类中引起不希望的免疫反应的风险(Takeuchi, Trendsin Glycosc1.Glycotechnol.9:S29-S35 (1997) ；Rosenfeld and Ballou, J.B1l.Chem.249: 2319-2321 (1974))。因而，希望的是在真菌宿主细胞中生产治疗性糖蛋白，在所述宿主细胞中糖蛋白上的糖基化模式相同于、或类似于在人类中产生的糖蛋白上发生的模式，并且不具有可检测的β_甘露糖基化。如在未感染的个体中保护性抗体的存在所证明的，β -连接的甘露聚糖可能是免疫原性的，或不利地影响施用包含β_连接的甘露聚糖的治疗蛋白质或糖蛋白的个体。另外，在治疗蛋白质上暴露的甘露糖基团被巨噬细胞上的甘露糖受体快速地清除，导致低药物效力。因而，在真菌宿主例如巴斯德毕赤氏酵母中表达的异源治疗蛋白质的或化连接的聚糖上β-连接的甘露糖残基的存在不是期望的，考虑到它们的免疫原性可能性以及它们与清除因子结合的能力。在巴斯德毕赤氏酵母中制造的糖蛋白已经被报道含有β_连接的甘露糖残基。在2003年，Trimble等(Glycob1l.14: 265-274，Epub Dec 23)报道了在巴斯德毕赤氏酵母中表达的重组的人胆汁盐刺激脂肪酶(hBSSL)中β_1，2-连接的甘露糖残基的存在。已经在巴斯德毕赤氏酵母和白色念珠菌(Candida albicans)中鉴定了编码几种β _甘露糖基转移酶的基因(参见美国专利 N0.7，465，577 和 Milleei a人，J.B1l.Chem.283: 9724-9736(2008))。根据上文，需要提供在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中制造重组治疗蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏在施用所述重组治疗蛋白质或糖蛋白的个体中可能引发不良反应的表位。确定重组治疗蛋白质或糖蛋白在施用给个体时是否提供了引发不良反应的风险的方法，是将重组治疗蛋白质或糖蛋白与针对总宿主细胞抗原制备的抗体接触。对于预期长期施用的蛋白质或糖蛋白这是特别关注的。缺乏与抗体的交叉结合表明所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。因而，需要生产重组治疗蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。
技术实现思路
本专利技术提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本专利技术提供了利用重组的甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母菌株来生产重组蛋白质和糖蛋白的方法，所述酵母不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自β_甘露糖基转移酶1、β_甘露糖基转移酶3和β_甘露糖基转移酶4的对于Ar-聚糖或聚糖的至少一种活性。在一个方面,所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母菌株，其中编码甘露糖基转移酶2的基因，以及编码选自β-甘露糖基转移酶1、3和4的β -甘露糖基转移酶的至少一种基因(分别为基因ΒΜΤ1』ΜΤ3』ΜΤ4、被删除或破坏或突变以产生无活性的β_甘露糖基转移酶，来生产重组蛋白质和糖蛋白。在其他方面β -甘露糖基转移酶1、β -甘露糖基转移酶3和β -甘露糖基转移酶4的一种或更多种的活性利用β -甘露糖基转移酶抑制物来取消，所述抑制物包括但不限于化合物、针对编码β -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的反义DNA，针对编码β -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的siRNA。 这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以生产蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的 甘露糖苷酶抗性的β_甘露糖残基。本专利技术进一步提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产双唾液酸化的人促红细胞生成素的方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性。所述方法和宿主细胞允许产生重组治疗蛋白质和糖蛋白，与此处公开的未修饰的菌株中生产的相比，其在施用所述重组治疗蛋白质和糖蛋白的个体中具有引发不良反应的降低的风险。所述方法和宿主细胞对于生产具有结合清除因子的更低可能性的重组蛋白质或糖蛋白也是有用的。在一个方面，本专利技术提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自β-甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的、对聚糖或O-聚糖的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现对聚糖或O-聚糖的β_甘露糖基转移酶4活性。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝N‑聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括：（a） 提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸封端的双分枝N‑聚糖，并且不展现对于N‑聚糖或O‑聚糖的β‑甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自对于N‑聚糖或O‑聚糖的β‑甘露糖基转移酶1活性和β‑甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白，所述信号肽靶向ER并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；（b） 在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及（c） 从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝N‑聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
【技术特征摘要】
2009.10.16 US 61/2523121.一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括: Ca)提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸封端的双分枝聚糖，并且不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白，所述信号肽靶向ER并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去; (b)在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及 (c)从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的甘露糖基转移酶2活性、 β-甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性。3.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或聚糖的β-甘露糖基转移酶4活性。4.权利要求1的方法，其中所述信号肽是酿酒酵母aMATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。5.权利要求1的方法，其中至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，并且至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿...
【专利技术属性】
技术研发人员：P多布罗维奇，S戈马蒂纳亚加姆，S哈密尔顿，H李，N塞图拉曼，TA斯塔黑姆，S维尔德特，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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