一种含油污泥中石油降解菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含油污泥中石油降解菌，所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油降解菌(RS1)，其保藏编号CGMCC8647，经过试验证实，RS1对饱和烃的降解率较高，达20.74％，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为39.69％，该细菌对石油的最适降解条件为37℃、盐度0.5％～5％、pH6～8。

【技术实现步骤摘要】
一种含油污泥中石油降解菌及其应用
本专利技术属于微生物领域，涉及降解石油烃的菌株，尤其是一种含油污泥中石油降解菌及其应用。
技术介绍
石油是当今社会生活生产中必不可少的能源之一，同时也是全球公认的对环境最具严重影响的污染物之一。石油的勘探、开发和加工运输过程中会产生大量含油污泥。含油污泥中通常含有烷烃、芳香烃、非烃化合物和沥青质等物质，会通过土壤和地下水污染生态环境威胁人类健康，因此，含油污泥的安全处置是一个重大问题。含油污泥的处理处置，主要涉及油含量的减少以及水和油泥的分离。当前焚烧、制砖等处理方法均有一定局限性，而利用微生物对石油污染进行降解修复安全性高、无二次污染，是一项成本低、效益高且环境友好型的处理技术。由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。申请者从渤海油田含油污泥中分离出一株高效石油烃降解菌，并进一步研究菌株对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含油污泥中石油降解菌及其应用，本专利技术提供的菌种在盐度为0.5％～5％的环境下对石油烃具有25％以上的降解率。本专利技术实现目的的技术方案是：一种含油污泥中石油降解菌，其特征在于：所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCCNo.8647，分类号为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum，保藏日期：2013年12月27日。而且，所述降解菌对饱和烃的降解率达20.74％。而且，所述降解菌对石油的降解条件分别为37℃、盐度0.5％～5％、pH6～8。而且，所述降解菌对含油污泥中总石油烃的降解率为39.69％。含油污泥中石油降解菌作为含油污泥净化剂的应用。本专利技术的有益效果和优点是：本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油降解菌，通过16SrRNA基因序列鉴定RS1，其保藏编号CGMCCNo.8647，经过试验证实，RS1对饱和烃的降解率最高，达20.74％，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为39.69％，该细菌对石油的最适降解条件为37℃、盐度0.5％～5％、pH6～8。附图说明图1为本专利技术温度对降解率的影响；图2为本专利技术盐度对降解率的影响；图3为本专利技术pH值对降解率的影响；图4为本专利技术TPH降解率随时间变化；图5为本专利技术菌株对石油烃不同组分的降解效果。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本申请通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株的各项优异性能，具体内容如下：1材料与方法1.1含油污泥含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70.55％，pH值为6.4，盐度3.0％。1.2培养基1.2.1富集分离培养基(g/L)酵母粉3，NaCl5，MgSO4·7H2O0.25，(NH4)2SO41，K2HPO410，KH2PO44，pH7.2～7.4。1.2.2斜面固体培养基LB固体培养基。1.2.3含油液体培养基(g/L)酵母粉3，NaCl5，MgSO4·7H2O0.25，(NH4)2SO41，K2HPO410，KH2PO44，原油10，pH7.2～7.4。1.3降解菌的分离和形态观察(1)称取10g含油污泥样品，加入40mL吐温80-水溶液(1‰v/v)，静置1～2h。取上层悬浊液1mL加到含有9mL吐温水的试管中，重复以上步骤3次。分别取100μL菌悬液涂抹于富集固体培养基平板，于培养箱中37℃培养24h。(2)挑取形态不同的单独菌落，接种于装有50mL液体富集培养基的150mL锥形瓶中，每个菌种做3个平行，将锥形瓶置于恒温震荡培养箱中37℃、100rpm培养24h后进行划线分离。(3)重复步骤(2)对菌株进行纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于斜面固体培养基，4℃保存。以上实验均在无菌操作条件下进行。使用扫描电镜(SEM)对分离菌株进行形态观察。菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的石油降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为：27F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′；1492R：5′CTACGGTTACCTTGTTACGAC3′；PCR反应体系(50μL)为：Mix25μL，模板2.0μL，引物各1.0μL，ddH2O21μL。PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，以上共进行30个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。1.4菌株的鉴定菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的石油烃降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为：27F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′；1492R：5′CTACGGTTACCTTGTTACGAC3′；PCR反应体系(50μL)为：Mix25μL，模板2.0μL，引物各1.0μL，ddH2O21μL。PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，以上共进行30个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。1.5降解菌的最适降解条件将活化后的降解菌接种于装有50mL含油液体培养基的150mL三角瓶中，采用单因素实验，在其它条件因素相同的情况下，分别改变温度、盐度和pH条件进行摇瓶培养，培养7d，每组实验做三个平行，对照组不接种降解菌。采用紫外分光光度法测定培养基中石油含量，计算降解率η(％)：温度、盐度和pH值分别设定为以下几个梯度：(1)温度：22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、50℃；(2)盐度：0.5％、1％、2％、3％、5％、7％、8％；(3)pH：4、5、6、7、8、9、10、11。2结果与讨论2.1降解菌的分离和形态通过扫描电镜观察到RS1大小为0.6～0.8μm×0.8～1.4μm，RS1为椭圆形，2.2菌株的16SrRNA基因鉴定测序结果显示细菌的16SrRNA基因序列长度分别为1422bp，将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息(表1)。表1菌株的16SrRNA基因序列BLAST比对结果2.3菌株的最适降解条件2.3.1最适降解温度由图1可以看出，RS1对温度的适应性较好，在实验所选的温度范围内对石油均有超过10％的降解，其降解的最适温度范围为27℃～42℃，37℃时其对石油降解率最高。温度直接影响酶的活性，而微生物作用于原油主要依靠酶催化反应对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含油污泥中石油降解菌，其特征在于：所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。

【技术特征摘要】
1.一种含油污泥中石油降解菌作为含油污泥净化剂的用途，其特征在于：所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCCNo.8647，分类命名为谷氨酸棒杆菌C...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宪斌，任丽君，田胜艳，赵兴贵，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12