本发明专利技术涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本发明专利技术还涉及包含EBV基因组的多核苷酸，所述EBV基因组：a)缺乏选自BFLF1基因、BBRF1基因、BGRF1基因、BDRF1基因、BALF3基因、BFRF1A基因和BFRF1基因的至少一个可表达基因；和b)在适宜的宿主细胞中产生本发明专利技术的EB-VLP。本发明专利技术进一步涉及包含本发明专利技术的多核苷酸的载体和宿主细胞，以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于接种目的的来自EB病毒的第二代病毒样颗粒(VLP)本专利技术涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本专利技术还涉及包含EBV基因组的多核苷酸，所述EBV基因组a)缺乏选自BFLF1基因、BBRF1基因、BGRF1基因、BDRF1基因、BALF3基因、BFRF1A基因和BFRF1基因的至少一个可表达基因，b)在适宜的宿主细胞中产生本专利技术的EB-VLP。本专利技术进一步涉及包含本专利技术的多核苷酸的载体和宿主细胞，以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。致癌性EB病毒(EBV)隶属于可以潜伏性感染人B淋巴细胞的γ疱疹病毒家族。EBV在超过90％的人群中建立持续终生的B细胞感染(Kieff和B.Rickinson.(2006),Epstein-Barrvirusanditsreplication,在D.M.Knipe和P.M.Howley编辑),Fieldsvirology,第5版Lippincott-Raven,Philadelphia,PA.2603-2654中；Küppers,R.(2003).Bcellsunderinfluence:transformationofBcellsbyEpstein-Barrvirus,Nat.Rev.Immunol.3:801–812)。在健康个体中，大多数EBV感染的B细胞显示有限的病毒基因表达和静息表型。潜伏性感染的细胞终端分化为浆细胞导致病毒再活化、产生，并再感染B细胞(Laichalk,L.L.和D.A.Thorley-Lawson.(2005),TerminaldifferentiationintoplasmacellsinitiatesthereplicativecycleofEpstein-Barrvirusinvivo.J.Virol.79:1296-1307)。所有病毒潜伏基因的表达导致生长转化和感染的B细胞的增殖，其在体外反映为EBV转化的类淋巴母细胞B细胞系的派生，在体内反映为EBV与包括不同类型的淋巴瘤的多种B细胞淋巴组织增生性疾病的相关。如EBV相关恶性肿瘤在先天性或医源诱发性T细胞机能障碍患者中提高的发病率(Rickinson,A.B.和E.Kieff.(2006),Epstein-Barrvirus,在D.M.Knipe和P.M.Howley(编辑),Fieldsvirology,第5版Lippincott-Raven,Philadelphia,PA.,2655–2700中)及通过多克隆EBV特异性T细胞系的输注成功治疗了造血干细胞移植受体中的EBV相关移植后淋巴组织增生性疾病(Rooney,C.M.等,(1998),InfusionofcytotoxicTcellsforthepreventionandtreatmentofEpstein-Barrvirus-inducedlymphomainallogeneictransplantrecipients.Blood92:1549–1555)所显示，EBV感染受T细胞控制。因此，本领域中存在发展疫苗来预防或清除EBV感染的需要。这种疫苗将适用于表观健康的个体，所以这种疫苗的安全性将是主要的顾虑。迄今为止，只有抗EBVgp350的肽疫苗可购得。但是，此疫苗的第一期临床试验显示，它未在EBV阴性移植受体中预防EBV感染(ReesL等(2009),AphaseItrialofEpstein-Barrvirusgp350vaccineforchildrenwithchronickidneydiseaseawaitingtransplantation.Transplantation88(8):1025-9)。病毒样颗粒(VLP)是与成熟病毒粒子相似或相同但缺乏病毒基因组的结构。通常，它们以比例如单体肽高的程度刺激宿主的免疫反应，这就是为什么优先用它们针对几种病毒(如乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒)进行接种(Greenstone,H.L.等(1998),Chimericpapillomavirusvirus-likeparticleselicitantitumorimmunityagainsttheE7oncoproteininanHPV16tumormodel.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:1800–1805；Mandic,A.和T.Vujkov.(2004).Humanpapillomavirusvaccineasanewwayofpreventingcervicalcancer:adreamorthefuture？Ann.Oncol.15:197–200)。VLP疫苗方案的关键安全性方面是，所使用的VLP必须不含病毒基因组(DNA或RNA)，因为否则接种可诱发病毒复制和/或病毒的潜伏性感染。EBV和其他疱疹病毒的病毒裂解性复制(即导致形成后代病毒颗粒的过程)是由不同蛋白质种类的连续激活引起的复杂过程。在裂解性复制过程中，病毒基因组从不同复制起点扩增几千倍，形成高度分支的结构。然后这些巨大的多联体分解为单位长度的线性病毒基因组，所述单位长度的线性病毒基因组将在感染的细胞核内包装入预先形成的前衣壳。包含病毒DNA的衣壳将经历进一步的构象和结构变化，并作为有包膜的病毒粒子颗粒从感染细胞排出(Roizman,B.和D.M.Knipe.(2001),Herpessimplexvirusesandtheirreplication,在D.M.Knipe,P.M.Howley,D.E.Griffin,R.A.Lamb,M.A.Martin,B.Roizman和S.E.Straus(编辑),Fieldsvirology,第4版,2卷LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,2399–2459页中)。导致EBV衣壳化的一种必需的顺式元件是位于线性基因组两端的末端重复序列(TR)，其涉及从病毒裂解性复制期间形成的多联体切出单个病毒基因组以及它们的包装。已产生了缺失这些末端重复序列的EBV突变株(delTR-EBV)。已显示，诱导裂解周期后，产生大量空的EB-VLP，基因组衣壳化的效率显著低，因为与使用对照EBV时的29％相比，少至0.001％用包含delTR-EBV的上清感染的细胞表达来自所述基因组的标记基因(FeederleR等,(2005),Defectiveinfectiousparticlesandrarepackagedgenomesproducedbycellscarryingterminal-repeat-negativeEpstein-Barrvirus.J.Virol.79；7641-7)。这表明，末端重复序列对基因组衣壳化很重要，但并非绝对必需。此外，已显示，从delTR-EBV产生的VLP仍然(虽然罕见)感染细胞，因此不保证delTR-EBVVLP用作疫苗的安全性。总的来说，虽然存在需要，但迄今尚未发展出用于产生针对EBV的安全而有效的疫苗的方法。因此，基于本专利技术的技术问题可以视为提供允许有效产生EBV疫苗的手段和方法。通过权利要求和下文中表征的实施方案来本文档来自技高网...
【技术保护点】
EB病毒样颗粒(EB‑VLP)，其基本不含EB病毒(EBV)DNA。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.30 EP 11196215.51.EB病毒样颗粒(EB‐VLP)，其基本不含EB病毒(EBV)DNA，其中与缺失末端重复序列的EBV突变株(△TR‐EBV)产生的VLP相比，在所述基本不含EBVDNA的EB‐VLP中，不含EBVDNA的VLP的数目增加，其中所述EB‐VLP缺乏选自BFLF1基因和BBRF1基因的至少一个可表达基因。2.权利要求1的EB‐VLP，其进一步包含至少一种人工多肽。3.权利要求1的EB‐VLP，其缺乏至少一种非必需EBV多肽。4.权利要求1的EB‐VLP颗粒的用途，用于制备药物，所述药物用于治疗和/或预防EBV‐相关疾病。5.权利要求1的EB‐VLP颗粒的用途，用于制备疫苗，所述疫苗用于治疗和/或预防EBV‐相关疾病。6.包含EB病毒(EBV)基因组的多核苷酸，所述EB病毒基因组：a)缺乏选自BFLF1基因和BBRF1基因的至少一种可表达基因；和b)能够在适宜的宿主细胞中产生权利要求1的EB‐VLP。7.权利要求6的多核苷酸，其还缺乏至少一种可表达的潜伏...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·菲德勒，S·洪特，HJ·德勒克鲁斯，
申请(专利权)人：德国癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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