本发明专利技术涉及一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法及应用，将电化学标记物硫堇吸附在金-铂纳米粒子(Au@PtNPs)表面，再将巯基DNA1固定在Au@PtNPs表面，得电化学探针(DNA1/Th/Au@PtNPs)；再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNA1与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNA1/Th/Au@PtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs；然后将碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNA1的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，测电化学信号，通过电化学信号强弱实现了电化学方法对多巴胺的定量测定。本发明专利技术的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及及应用，将电化学标记物硫堇吸附在金-铂纳米粒子(Au@PtNPs)表面，再将巯基DNA1固定在Au@PtNPs表面，得电化学探针(DNA1/Th/Au@PtNPs)；再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNA1与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNA1/Th/Au@PtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs；然后将碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNA1的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，测电化学信号，通过电化学信号强弱实现了电化学方法对多巴胺的定量测定。本专利技术的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。【专利说明】—种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法
本专利技术属于分析化学和电化学领域，具体涉及一种性检测多巴胺的电化学方法。
技术介绍
多巴胺(DA)是一重要的信息传递物质，其含量的改变可导致一些重要疾病如帕金森氏症等。因此，多巴胺的测定一直是分析化学、生物和医学领域的研究热点。电化学测定多巴胺有较高的灵敏度，但由于大量抗坏血酸(AA)与多巴胺共存于脑内，其在固体电极上的氧化电位与多巴胺重叠，因而严重干扰多巴胺含量的测定。近年来，提出了一些基于适体技术检测多巴胺的方法。如光度法(Yu Zheng, YongWang, Xiurong Yang, Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine usingunmodified gold nanoparticles.Sensors and Actuators B, 156(2011)95-99)、突 光法(Qin Mu, Hu Xu,Yan Li, Shijian Ma, Xinhua Zhong, Adenosine capped QDs basedfluorescent sensor for detection of dopamine with high selectivity and sensitivity.Analyst, 139 (2014) 93-98)、酶联免疫方法(Hoyoung Park, Insook Rhee Paeng, Developmentof direct competitive enzyme-linked aptamer assay for determination of dopaminein serum.Analytica Chimica Acta, 685(2011)65-73;Eunhye Kim, Insook RheePaeng, Advantageous sensitivity in the DNA homolog of the RNA dopamine aptamer.Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 35 (2014) 83-100)等，然而这些检测方法大都灵敏度低，操作繁琐，而且耗时较多。因此，必须发展一种简单，低成本，快速的检测方法用于多巴胺的分析检测。
技术实现思路
:将电化学标记物硫堇吸附在金-钼纳米粒子(Au@PtNPs)表面，再将巯基DNAl固定在AuOPtNPs表面，得电化学探针(DNAl/Th/AuiPtNPs);再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNAl与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNAl/Th/Au@PtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs ;然后将碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNAl的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，测电化学信号，通过电化学信号强弱实现了电化学方法对多巴胺的定量测定。本专利技术是通过以下措施来实现的:，其特征是包括以下步骤:(I)制备电化学探针；(2)制备碳纳米粒子修饰金电极；(3)电化学检测多巴胺。优选的，本专利技术所述的电化学探针制备包括以下步骤:取2mL的离心管，加入10μ LKT5M的DNAl和10 μ L pH5.2500mM的醋酸缓冲溶液，和10 μ LlOmM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应lh，用以活化巯基。然后，另取2mL离心管依次加入直径15nmlmLAu@PtNPs和100 μ L10_4M的硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金-钼纳米粒子上。将吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巯基DNAl中，放入37°C摇床轻摇反应16h。使巯基DNAl与AuOPtNPs通过Au-S键连接起来。再向体系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用IOmM pH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在IOmM pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNAl/Th/AuOPtNPs电化学探针，4°C避光保存。优选地，本专利技术所述的碳纳米粒子修饰金电极制备包括以下步骤:用NaCOJfCNPs调节pH至7.0，移至2mL离心管在15000转速下离心10min0离心产物用0.01M ρΗ7.0磷酸缓冲溶液洗涤3次。将产物用0.01M ρΗ7.0的磷酸缓冲溶液分散，取10 μ L滴在金电极表面得碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)，置阴凉处风干备用。优选地，一种对多巴胺的检测方法，其特征是:取20μ L10_5M的DNA2加入电化学探针(DNAl/Th/Au@PtNPs)溶液中，反应2h后，14000转速下离心30min，用10mM，pH8.0磷酸缓冲溶液洗涤三次，再用ImL磷酸缓冲溶液分散。在2mL离心管中加入20 μ L上述溶液，再加入10 μ L —定浓度的多巴胺,反应30min后将碳纳米粒子修饰金电极插入反应30min,用磷酸缓冲溶液冲洗。以上述修饰金电极作为工作电极，将电极插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法或微分脉冲伏安法(DPV)测电信号(Ip)，电位增量0.0OlmV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。具体实验原理如图1所示。碳纳米粒子修饰金电极对电化学行为的影响如图2所示。(a)无DA时CNPs/GE的 DPV 曲线；(b)在 10 μ L3.0X l(T6mol L-1DA 时 GE 的 DPV 曲线；(c)在 10 μ L3.0X l(T6molL^1DA 时 CNPs/GE 的 DPV 曲线吸附时间对电化学信号强度的影响如图3所示。峰电流与多巴胺浓度的标准曲线图如图4所示。电化学测定多巴胺的选择性如图5所示。本专利技术中的检测条件，具体特征如下:多巴胺与DNA2修饰的探针作用后，将碳纳米粒子修饰金电极插入溶液，碳纳米粒子修饰金电极将吸附生成的探针，吸附时间对电化学信号有着极大的影响。考察了吸附时间对电化学信号的影响。结果如图3所示，用吸附时间和电化学信号作图，从图中可以看出，在10到4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法，包括如下步骤： (1)取2mL的离心管，加入1～30μL10‑5M的DNA1和10μL pH5.2的500mM的醋酸缓冲溶液，和10μL10mM的三(2‑羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应1h，用以活化巯基；然后，另取2mL离心管依次加入直径15nm，1mL的Au@PtNPs和100μL10‑4M的硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金‑铂纳米粒子上；将吸附了硫堇的Au@PtNPs加入到活化好的巯基DNA1中，放入37℃摇床轻摇反应8～32h；使巯基DNA1与Au@PtNPs连接起来；再向体系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mMpH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/Au@PtNPs电化学探针； (2)用NaCO3将CNPs调节pH至7.0，移至2mL离心管在15000转速下离心10min；离心产物用0.01M，pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤3次；将产物用0.01M，pH7.0的磷酸缓冲溶液分散，取10μL滴在金电极表面得碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)； (3)取5～40μL10‑5M的DNA2加入电化学探针(DNA1/Th/Au@PtNPs)溶液中，反应0.5～4h后，14000转速下离心30min，用10mM，pH8.0磷酸缓冲溶液洗涤三次，再用1mL磷酸缓冲溶液分散；在2mL离心管中加入20μL上述溶液，再加入2～20μL一定浓度的多巴胺，反应30min后将碳纳米粒子修饰金电极插入反应10～60min，用磷酸缓冲溶液冲洗后测定电化学信号； 所述的DNA1的部分序列为：5’‑GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGC CC‑HS‑3’； 所述的DNA2的部分序列为：5’‑GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，张云飞，刘芳，柏莉，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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