一种两端标记相对定量分析糖链的方法技术

本发明专利技术公开了一种两端标记相对定量分析糖链的方法，属于糖类定量分析领域。本发明专利技术通过酰肼化试剂和胺基化试剂分别对糖链结构唾液酸酰胺化和对还原端氨基化修饰，同时保护了糖链结构的唾液酸基团并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时得到分析，提高了糖链解析的全面性和定量的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种两端标记相对定量分析糖链的方法
本专利技术涉及一种两端标记相对定量分析糖链的方法，属于糖类定量分析领域。
技术介绍
糖类物质是一类大量存在于生物机体中的大分子物质，在生物体的各个过程中年扮演着重要的角色。糖类物质的存在形式主要是糖类复合物，如糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、脂多糖等。其中糖基化蛋白质广泛分布于细胞表面和细胞外基质中，其上的糖链结构与很多的重要的生物功能相互关联，主要包括调节蛋白的构象和稳定性，控制蛋白质甚至细胞的半衰期。另外，这些糖链结构作为配体的特异性结合介导蛋白的靶向识别，细胞与细胞以及细胞与胞外基质相互作用。生物体中的糖蛋白一般包括多个糖基化位点，而其每个糖基化位点的糖链结构具有其特异的糖型。因此鉴定糖蛋白上所有的糖链结构是非常具有挑战性，其中包括鉴定糖蛋白上的糖基化位点，分析每个糖型结构中的糖链组成，糖链序列，分支类型以及糖链残基中的羟基基团与其他残基的连接方式。现在没有一种技术可以完全得到糖蛋白糖基化修饰所有信息，只有将多种方法联合起来，如多种质谱技术联合，再加上糖链生物合成通路特点才能得到糖链的信息。定量糖组学分析技术被认为是分析糖类复合物及其糖链结构在众多生物过程中所扮演角色的最有力的方法。最近几年，随着糖组学技术和其他新兴仪器方法的发展，很多定量糖组学的方法也得到了长足的发展。目前定量糖组学常用的方法有：液相色谱技术，毛细管电泳技术，以及质谱技术。在这些定量分析糖链的方法中，质谱技术是其中最有用最直接的方法。而利用质谱技术定量糖组学分析方法一般都需要对糖链进行修饰标记，同时促进糖链在质谱检测中的离子化效率和定量的准确度。目前用糖链定量质谱分析的糖链标记方法主要有：糖链还原端同位素标记方法(GRIL)，同位素泛甲基化标记方法，同重醛类物质标记方法(iARTs)，同位素酰肼标记方法(IGHT)，以及同位素谷氨酸盐氨基糖标记方法(IDAWG)。这些方法均是通过分析用不同的同位素试剂标记不同样本，然后利用质谱检测同位差异分子量的样品相对丰度或面积，从而将不同样品在一次质谱分析中进行检测。以上方法对糖链的定量各有其优点，但是除泛甲基化的方法以外均存在丢失唾液酸信息的缺点；而泛甲基化方法由于所有的羟基均被甲基化，所以很多糖链的结构信息会被掩盖。
技术实现思路
为在质谱检测和定量分析糖链的过程中同时保护糖链结构的唾液酸并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时被分析，提高糖链解析的全面性和定量的准确性，本专利技术提供了一种两端标记相对定量分析糖链的方法，首先通过酰肼化试剂对样品的糖链结构的唾液酸进行酸酰胺化，酶解释放糖链后，用同位素标记的氨基化试剂分别对两种样品的糖链的还原端进行氨基化修饰，然后通过MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，比较分别经同位素标记的氨基化试剂修饰的两种样品中相应糖链的含量差异。所述酰肼化试剂优选乙酰肼。所述同位素标记的氨基化试剂优选12C-和13C-苯胺。所述方法主要包括以下步骤：(1)将需要进行相对定量分析的两种样品的糖蛋白用乙酰肼标记，保护糖链结构的唾液酸基团；(2)用糖苷酶PNGaseF酶解释放两种样品中的糖蛋白的糖链；(3)分别用12C-和13C-苯胺修饰来自两种样品的糖链还原端；(4)取以上来自两种样品的分别经12C-和13C-苯胺修饰的糖链，等量溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理；所述经12C-和13C-苯胺修饰的糖链优选以质量体积比1：3(g：L)溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中；(5)应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)解析糖链，从一级图谱中选择信噪比大于6的质谱峰进行二级质谱分析；通过比较分别经12C-和13C-苯胺修饰的两种样品中相应糖链的相对面积比例以确定某种糖链在不同样品中的含量差异。(6)将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况，分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。所述方法进一步优选以下步骤：(1)用Bradford或者BCA方法定量两个样品中的蛋白质，每个样品各取2mg左右蛋白质，用10-30KD超滤膜进行除盐处理；(2)乙酰肼标记：向以上除盐的2mg的蛋白质中加入100μL1M乙酰肼、20μL1N盐酸、20μL2MEDC，于室温下反应4h，14000g离心10min，加入150μL40mM的NH4HCO3至超滤管中，14000g离心10min，重复3次。(3)糖苷酶PNGaseF酶解释放糖链：将超滤管转移至新的收集管中，加入用300μL的40mM的NH4HCO3溶解的PNGaseF(300000U/mL)充分混匀37℃静置孵育12h，14000g离心10min，加200μL超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复一次，收集流出液，冷冻干燥得糖链干粉。(4)12C-和13C-苯胺修饰糖链还原端：向步骤(3)所得来自两个样品的糖链中分别加入10μL的12C-苯胺溶液和10-25μL的13C-苯胺溶液，再各自加入25μLNaCNBH3(溶于v/v为7/3的DMSO/乙酸溶液)，于70℃孵育反应15min，反应获得的苯胺修饰的糖链分别冷冻干燥；将获得的分别经同位素标记的糖链分别等量溶解于300μL5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理。所述13C-苯胺溶液优选10μL。(5)糖链的除盐处理：加100μL的Sepharose4B分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1：1的甲醇：水溶液1mL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液1mL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。将步骤(4)得到的糖链样品上样至上述含Sepharose4B的离心管中混匀，25℃振荡反应1h。14000g离心15min，弃上清，重复清洗3次。再加入1：1的甲醇：水溶液1mL摇匀，25℃振荡20min，14000g离心15min，收集样品并冷冻干燥。(6)定量分析：将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况，分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。通过比较12C-和13C-苯胺修饰的糖链的相对面积(RelativeArea)比例以确定某种糖链在不同样品含量差异。本专利技术提供了一种两端标记定量分析糖链的方法，通过酰肼化试剂和胺基化试剂分别对糖链结构唾液、还原端进行酸酰胺化、氨基化修饰。在质谱检测和定量分析糖链的过程中同时保护糖链结构的唾液酸并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时被分析，提高糖链解析的全面性和定量的准确性。而现有技术均存在丢失唾液酸糖链信息本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种两端标记相对定量分析糖链的方法，其特征在于，首先通过酰肼化试剂对样品的糖链结构的唾液酸进行酸酰胺化，酶解释放糖链后，用同位素标记的氨基化试剂分别对两种样品的糖链的还原端进行氨基化修饰，然后通过MALDI‑TOF/TOF‑MS解析糖链，比较分别经同位素标记的氨基化试剂修饰的两种样品中相应糖链的含量差异。

【技术特征摘要】
1.一种两端标记相对定量分析糖链的方法，其特征在于，首先通过酰肼化试剂对样品的糖链结构的唾液酸进行酸酰胺化，酶解释放糖链后，用同位素标记的氨基化试剂分别对两种样品的糖链的还原端进行氨基化修饰，然后通过MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，比较分别经同位素标记的氨基化试剂修饰的两种样品中相应糖链的含量差异；主要包括以下步骤：(1)将需要进行相对定量分析的两种样品的糖蛋白用乙酰肼标记，保护糖链结构的唾液酸基团；(2)用糖苷酶PNGaseF酶解释放两种样品中的糖蛋白的糖链；(3)分别用12C-和13C-苯胺修饰来自两种样品的糖链的还原端；(4)取以上来自两种样品的分别经12C-苯胺、13C-苯胺修饰的糖链，等量溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理；(5)应用MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，从一级图谱中选择信噪比大于6的质谱峰进行二级质谱分析；通过比较分别经12C-和13C-苯胺修饰的两种样品中相应糖链的相对面积比例以确定某种糖链在不同样品中的含量差异；将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况；具体包括以下步骤：(1)每个样品各取2mg蛋白质，用10-30KD超滤膜进行除盐处理；(2)乙酰肼标记：向以上除盐的2mg的蛋白质中加入100μL1M乙酰肼、20μL1N盐酸、20μL2MEDC，于室温下反应4h，14000g离心10min；加入150μL40mM的NH4HCO3至超滤管中，14000g离心10min，重复3次；(3)糖苷酶PNGaseF酶解释放糖链：将超滤管转移至新的收集管中，加入用300μL的40mM的NH4H...

【专利技术属性】
技术研发人员：关锋，杨刚龙，谭增琦，陆微，庞星辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32