一种快速制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效省时的制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的新方法。具体的步骤包括：1)将不同的抗生素共价链接到同一个蛋白质载体上，用交联的抗生素蛋白偶联物免疫小鼠；2)分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，并进行选择性培养；3)筛选出产生不同目的抗抗生素单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，并分别进行保存；4)分别利用步骤(3)所述的不同杂交瘤细胞株制备单一的抗抗生素单克隆抗体。本发明专利技术建立了一种可通过一次融合同时获得多个抗不同抗生素的单克隆抗体方法。大大降低了单克隆抗体制备的时间和成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种快速高效省时的制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的新方法。具体的步骤包括：1)将不同的抗生素共价链接到同一个蛋白质载体上，用交联的抗生素蛋白偶联物免疫小鼠；2)分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，并进行选择性培养；3)筛选出产生不同目的抗抗生素单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，并分别进行保存；4)分别利用步骤(3)所述的不同杂交瘤细胞株制备单一的抗抗生素单克隆抗体。本专利技术建立了一种可通过一次融合同时获得多个抗不同抗生素的单克隆抗体方法。大大降低了单克隆抗体制备的时间和成本。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗生素蛋白偶联物以及利用该偶联物快速高效省时的制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的新方法。
技术介绍
牛奶是老少皆宜的营养品，但随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视。1991年美国食品药物管理局(FDA)对234个鲜乳样品检测，只发现一个样品有抗生素磺胺二甲嘧啶残留。到1992年上半年年美国食品药物管理局(FDA)对197个鲜乳样品，抗生素磺胺残留的样品就有4个。欧美国家规定超过允许量标准的牛乳及其乳制品全部废弃处理，不得食用。所有抗生素残留超量的牛奶在欧美国家多年就已被禁止上市。我国也于2001年10月发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》。虽然对新鲜牛乳的抗生素指标明确了“抗生素不得检出”。但由于我国牛奶生产小规模，分散的特点，使得《无公害食品生鲜牛乳行业标准》难以执行，致使我国牛奶及奶制品中抗生素残留问题一直未能得到解决，牛奶安全问题还是一个极大的问题。牛奶中抗生素残留主要是由于抗生素使用不当引起。长期饮用有抗生素残留的牛奶会引起过敏反应，导致某些条件性致病菌易产生耐药性。因此研究开发简便、快速、准确、灵敏性高的检测方法日趋紧迫。 牛奶中的抗生素残留的检测方法主要有微生物检测法、高效液相色谱、气相色谱法、联用技术、超临界流体色谱、毛细管区域电泳法、免疫法等，目前基于免疫分析技术的ELISA试剂盒是奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法，此外，基于胶体金技术的快速纸条检测法，能在10分钟内特异检测出牛奶中的抗生素残余的量，有望得到快速发展。但开发ELISA试剂盒和胶体金纸条对所用的抗生素抗体的要求很高，因此其成本不低，主要是因为所用的原材料一抗抗生素的单克隆抗体价格高昂，因此研究开发一种高效制备抗抗生素单克隆抗体的新方法将会大大降低成本，提高经济效益。单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且可工厂化生产，来源容易。单克隆抗体用途广泛，在生物学、医学和其他研究领域中都显示了极大的应用价值。在医学领域中，单克隆抗体在疾病诊断、判断预后、防治以及致病机制研究等方面起着巨大的促进作用。迄今全球已研制出数千种单克隆抗体。尽管单克隆抗体在各个研究领域中的作用显得越来越重要，应用也越来越广泛，但是分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立却并非易事，因为制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、建立抗体检测方法、细胞融合、选择杂交瘤、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、稳定性测定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间获得细胞株。由于抗生素是半抗原，抗生素不能作为抗原免疫小鼠产生抗体，因此在生产抗抗生素的单克隆抗体时，都必须将抗生素和载体蛋白共价交联，用共价交联的抗生素蛋白偶联物免疫小鼠。以往制备抗抗生素的单克隆抗体方法都是将每种抗生素单独的和载体蛋白共价交联，然后每只小鼠只能免疫一种抗生素和载体蛋白共价偶联物，将这种免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，形成的杂交瘤细胞只能分泌针对这种抗生素的单一单克隆抗体。每一种抗体的制备至少需要6个月的时间。虽然用多种抗原同时免疫小鼠生产多个抗体的技术已建立，但对于抗抗生素的单克隆抗体的制备来说，同时用多种抗生素载体蛋白结合物免疫小鼠，由于载体蛋白的量过大，容易形成小鼠对载体蛋白的免疫耐受，载体蛋白的免疫抑制作用，抑制了小鼠对抗生素的免疫反应，因而导致抗抗生素抗体的效价降低，很难获得抗抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提供了一种快速高效省时的制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的新方法，通过将多种抗生素共同交联到一个载体蛋白上形成一个复合抗原免疫小鼠，同时得到每一种抗生素对应的杂交瘤细胞，再分别制备单一的抗抗生素单克隆抗体。本专利技术减低了用于免疫小鼠的载体蛋白量，可通过一次细胞融合，同时制备多个高价的抗多种抗生素的单克隆抗体，大大的节约时间和成本。 本专利技术技术方案如下: 一种抗生素蛋白偶联物，将多种抗生素通过交联剂与载体蛋白进行共价交联制得。所述抗生素选自青霉素，红霉素，金霉素，先锋霉素，链霉素，四环素，土霉素或庆大霉素中的两种或两种以上，优选青霉素，链霉素，四环素，土霉素和庆大霉素。上述的抗生素蛋白偶联物，所述抗生素数量没有特别限制，以能连接上的最大数量为上限，一般优选为2-5。上述交联剂为本 领域技术人员熟知的种类，优选EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亚胺)交联剂。上述载体蛋白选自球蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡丙种球蛋白。优选钥孔血蓝蛋白(KLH)。上述抗生素蛋白偶联物可选用常规方法进行制备，如申请号为201310593798.0公开的方法，或者使用成熟的商业试剂盒或交由商业公司完成，本专利技术所述的抗生素蛋白偶联物米用 Thermo Scientific 公司的Imjecl? EDC Carrier Protein Kits 制备得到。本专利技术提供了利用上述抗生素蛋白偶联物快速制备多种抗抗生素杂交瘤单克隆抗体的方法，包括如下步骤: 1)将本专利技术所述抗生素蛋白偶联物免疫小鼠； 2)分离小鼠的脾脏细胞，并将脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，并进行选择性培养； 3)筛选出产生不同目的抗抗生素单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并分别进行保存； 4)分别利用步骤(3)所述的不同杂交瘤细胞制备单一的抗抗生素单克隆抗体。 本专利技术通过将多种抗生素共同交联到一个载体蛋白上形成一个复合抗原，通过一次细胞融合，同时制备多个高价的抗多种抗生素的单克隆抗体，大大的节约时间和成本。使用本专利技术方法制得的单一抗抗生素单克隆抗体特异性强，可用于食品、农产品等抗生素含量的检测。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术方法制得的抗青霉素抗体的抑制ELISA检测结果。图2为本专利技术方法制得的抗链霉素抗体的抑制ELISA检测结果。图3为本专利技术方法制得的抗四环素抗体的抑制ELISA检测结果。图4为本专利技术方法制得的抗土霉素抗体的抑制ELISA检测结果。图5为本专利技术方法制得的抗庆大霉素抗体的抑制ELISA检测结果。【具体实施方式】实施例1抗生素一载体蛋白结合物的制备 抗生素与 KLH 的交联用 Imjcci EDC Carrier Protein Kits (Thermo Scientific)完成，具体操作按说明书进行。简单地说，将10毫克的K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗生素蛋白偶联物，其特征在于将多种抗生素通过交联剂与载体蛋白进行共价交联制得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖增祖，叶欣，徐健，杨奎东，赖晓娟，
申请(专利权)人：宁波艾科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33