本发明专利技术公开了一种双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子其在FTH1的N端或C端修饰有增强型绿色荧光蛋白。本发明专利技术的铁蛋白重链亚基纳米粒子修饰有增强型绿色荧光蛋白EGFP，与修饰有EGF的纳米粒子同时进行变复性，并在体外进行自组装，形成的杂合蛋白纳米粒子能够针对性地靶向肿瘤细胞并保持荧光活性，该纳米粒子的制备方法为实现生物大分子类的纳米载体的功能化修饰提供了新的方法和参考，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学工程
，具体涉及一种双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。
技术介绍
纳米材料的特性使其在肿瘤诊断分析方面具有许多优势，纳米技术的近期发展使得纳米级载体可以同时连接上各种功能性分子，包括对肿瘤特异识别的配体、抗体、抗癌药物以及成像探针等。生物笼状蛋白本身就是天然生物大分子，具有良好的生物兼容性。他们通常是由多个多肽亚基结合形成中空结构，外部与中空直径均在纳米尺度，使得纳米材料易于在其表面、内部以及各蛋白亚基界面之间进行修饰，组装成各种多功能分子。近来随着基因工程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这方面的工作已经引起了普遍的关注和兴趣。有大量研究表明，肿瘤细胞的表皮生长因子受体(epithelial growth factorreceptor, EGFR)表达量过高，这使得EGFR成为肿瘤治疗中一个非常好的靶点。表面修饰EGF的纳米粒子，能通过配体受体结合作用进入细胞，这为药物的传递提供了良好的可行性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的纳米粒子对肿瘤细胞的靶向作用过程中示踪性不够好，观察和分析不够方便，且功能单一的缺陷，而提供一种新的铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。本专利技术的铁蛋白重链亚基纳米粒子修饰有增强型绿色荧光蛋白EGFP，与修饰有EGF的纳米粒子同时进行变复性，并在体外进行自组装，形成的杂合蛋白纳米粒子能够针对性地靶向肿瘤细胞并保持荧光活性，该纳米粒子的制备方法为实现生物大分子类的纳米载体的功能化修饰提供了新的方法和参考，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。本专利技术提供下述技术方案解决上述技术问题。本专利技术提供的技术方案之一是:一种双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其在FTHl的N端或C端修饰有增强型绿色荧光蛋白。本专利技术中，所述的FTHl为本领域最常见的铁蛋白重链亚基纳米粒子(专利CN101942022A中已经对其做了详细披露)，其还可以是现有技术中已经报道过的任意的铁蛋白重链亚基纳米粒子。绿色荧光蛋白(GFP)，是源自维多利亚水母的新型报告分子，在蓝光或紫外光照射下其荧光发色团会发出绿色荧光，无需加任何辅助因子。而增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是钱永健等人在1995年运用S65T单点突变技术得到的光稳定性和荧光强度大幅增强的GFP突变体，其荧光强度为GFP的4~35倍，它具有非常稳定的构象，不易发生光漂白且易于检测，无论融合与蛋白质的N端还是C端都不会影响目的蛋白的构象的特点。与此同时，相对于生物发光成像，荧光成像无辐射、方便、直观、标记靶点多样、费用低，易于被大多数研究人员接受。在肿瘤的研究中，可为肿瘤的成像提供有效手段。本专利技术的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子优选在FTHl的N端修饰有增强型绿色荧光蛋白。较佳地，所述双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子在FTHl和增强型绿色荧光蛋白之间还连接有短肽。所述的短肽优选G4S短肽。所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子的氨基酸序列最优选如SEQ IDN0.1所示。本专利技术提供的技术方案之二是:一种杂合蛋白纳米粒子，其由修饰有增强型绿色荧光蛋白的铁蛋白重链亚基纳米粒子和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。本专利技术中，所述的EGF(Epidermal Growth Factor)为本领域常规所述的含义,其为表皮生长因子，是哺乳动物体内的一种小肽，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。较佳地，所述的杂合蛋白纳米粒子由N端修饰有增强型绿色荧光蛋白的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。本专利技术提供的技术方案之三是:如前所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤:(I)基因工程菌株的构建:分别构建表达修饰有增强型绿色荧光蛋白的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为PET-28 (+)，所用的宿主菌为大肠杆菌；(2)融合蛋白的表达和收获:将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白；(3)杂合蛋白纳米粒子的自组装:将步骤(2)收获的表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。步骤(1)中，所述的大肠杆菌优选E.coliBL21菌株。步骤(2)中，收获表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的方式为本领域常规所述，较佳地为将包涵体蛋白进行洗涤和纯化；或者，将可溶性蛋白进行凝胶过滤层析，以达到纯化的目的。步骤(3)中，所述的梯度透析复性较佳地包括如下步骤:将变性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白总浓度为0.lmg/mL ;用橡皮筋捆住透析袋的一端，将变性蛋白装入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；将透析袋置于复性液中，4°C条件下开始复性，复性过程中逐渐减低脲素的浓度，使得变性蛋白慢慢正确折叠，隔6h换一次复性液，经由St印I~Step6复性结束后，将透析袋里的蛋白溶液取出，离心，得上清液，用0.2μπι滤膜过滤除去未正确折叠的蛋白沉淀物。其中，所述复性液的配方优选如下:Stepl:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，4M脲素，0.2mM GSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；St印2:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，3M脲素，0.2mM GSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；St印3:50mMTris-OH,50mMNaCl,0.5mMEDTA,0.1% PEG(聚乙二醇)，10 % 甘油，2M脲素，0.2mM GSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；St印4:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，IM脲素，0.2mM GSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；St印5:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9 ；St印6:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9。本专利技术提供的技术方案之四是:如前所述的杂合蛋白纳米粒子在制备靶向肿瘤细胞的药物中的用途。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。 本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于:本专利技术通过基因工程手段分别对重链铁蛋白进行了靶向分子EGF及荧光分子EGFP的修饰，并且通过包涵体变复性的方法实现了两种不同功能的融合蛋白亚基的自组装，通过透射电子显微镜、Western Blotting、流式细胞仪等考察了纳米粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，其在FTH1的N端或C端修饰有增强型绿色荧光蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，其在FTHl的N端或C端修饰有增强型绿色荧光蛋白。2.如权利要求1所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，其在FTHl和增强型绿色荧光蛋白之间还连接有短肽。3.如权利要求2所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，所述的短肽为G4S短肽。4.如权利要求1所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，所述的双功能修饰的铁蛋白重链亚基纳米粒子的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。5.一种杂合蛋白纳米粒子，其特征在于，其由修饰有增强型绿色荧光蛋白的铁蛋白重链亚基纳米粒子和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。6.如权利要求5所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)基因工程菌株的构建:分别构建表达修饰有增强型绿色荧光蛋白的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为PET-28 (+)，所用的宿主菌为大肠杆菌； (2)融合蛋白的表达和收获:将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白； (3)杂合蛋白纳米 子的自组装:将步骤(2)收获的表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的大肠杆菌为E.coliBL21 菌株，和 / 或， 步骤(2)中，收获表达修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的方式为本领域常规...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹旭妮，蒋晓丹，王焦清，邱李辉，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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