用于从蛋白质溶液中除去病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于从包括一种靶蛋白的溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，从而将丙酮用作沉淀病毒和/或病毒DNA以及该靶蛋白的沉淀剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从蛋白质溶液中除去病毒的方法专利
本专利技术涉及一种用于纯化蛋白质的方法。专利技术背景分离自动物来源的蛋白质当例如在食品或药物产品中使用这些蛋白质时易于被不需要的病毒颗粒和/或病毒DNA污染。已知用于纯化此类蛋白质还将降低病毒颗粒和/或病毒DNA的水平的方法，例如层析、过滤、离心、提取或沉淀。然而，在一些情况下，纯化一种感兴趣的蛋白质是困难的、耗时的和/或昂贵的。所以，本专利技术的一个目的是提供一种用于从感兴趣的蛋白质中除去任何受污染的病毒颗粒和/或病毒DNA的方法。此类方法在工业规模中应该是快速的、有用的、廉价且有效的。胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一种发现于许多脊椎动物的消化系统内并在其中水解蛋白质的丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶在哺乳动物的胰脏中以高数量可获得，并且例如猪胰蛋白酶和牛胰蛋白酶可以相当容易地纯化。因此，胰蛋白酶已经被广泛地应用于各种生物技术工艺中。另外，将胰蛋白酶用于婴儿食品中以预消化蛋白质。2型猪环状病毒(PCV2)是一种在真核细胞中自主复制的小的无包膜病毒。它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病原，该综合征是一种在猪中新出现的且多因素的疾病。本专利技术的一个目的是提供一种用于从提取自猪胰腺的胰蛋白酶中除去PCV2病毒颗粒和/或病毒DNA的方法。专利技术概述本专利技术提供了一种用于从包括靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括：a)将丙酮以选择性地沉淀该病毒和/或病毒DNA的浓度添加至该溶液中，b)进行一个分离步骤，以将沉淀的材料与包括该靶蛋白的溶液分开，c)向该溶液中添加另外量的丙酮，以达到沉淀该靶蛋白的终浓度，并且d)从该溶液中收集沉淀的靶蛋白。专利技术详细说明本专利技术提供了一种用于从包括靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括：a)将丙酮以选择性地沉淀该病毒和/或病毒DNA的浓度添加至该溶液中，b)进行一个分离步骤，以将沉淀的材料与包括该靶蛋白的溶液分开，c)向该溶液中添加另外量的丙酮，以达到沉淀该靶蛋白的终浓度，并且d)从该溶液中收集沉淀的靶蛋白。为避免任何可能的疑问：以书面顺序进行这些步骤。即，在步骤b)中进行分离，以将步骤a)的沉淀材料与包括该靶蛋白的溶液分开。在步骤c)中，向在步骤b)中获得的溶液中添加另外量的丙酮。并且在步骤d)中，从该溶液中收集步骤c)的沉淀的靶蛋白。该靶蛋白可以是任何蛋白质。它可以是一种分离自微生物，例如分离自细菌细胞或真菌细胞的蛋白质。它可以是一种分离自植物的蛋白质。优选地，它是一种分离自动物来源的蛋白质。此类蛋白质可能易于被例如源自表达了该蛋白质的来源生物的病毒颗粒和/或病毒DNA污染。可以从一种哺乳动物来源获得该靶蛋白。它可以获得自哺乳动物组织，例如获得自哺乳动物腺体。在一个优选实施例中，该靶蛋白获得自牛或猪胰脏。在一个更优选实施例中，该靶蛋白获得自猪胰脏。该靶蛋白可以是一种酶，优选是一种活性酶或可以被再活化的酶。可以获得自哺乳动物胰脏(例如获得自猪胰脏)的酶类包括但不限于：蛋白酶，包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶B、胰肽酶E、羧肽酶A以及羧肽酶B；脂肪酶，包括但不限于甘油酯水解酶(脂肪酶)、磷脂酶A1、磷脂酶A2以及甾醇酯水解酶；核酸酶，包括但不限于核糖核酸酶以及脱氧核糖核酸酶；淀粉酶，包括但不限于α-淀粉酶。在一个优选实施例中，该靶蛋白是一种蛋白酶，优选是一种获得自哺乳动物来源的蛋白酶，例如获得自胰脏，优选获得自牛或猪胰脏，更优选获得自猪胰脏。在一个更优选实施例中，该靶蛋白是胰蛋白酶，优选获得自胰脏的胰蛋白酶，更优选获得自牛或猪胰脏的胰蛋白酶，甚至更优选获得自猪胰脏的胰蛋白酶。包括该靶蛋白的水溶液优选地具有一个低的导电性，例如低于3mS或低于1mS。这可以例如通过渗滤获得，例如使用具有10,000Da的截留的膜。包括该靶蛋白的水溶液优选具有约2-5，例如约3-4，优选约3.1-3.9，如约3.5的pH。该水溶液的干物质浓度可以是约8％-20％，例如约8％-15％，如约10％。在本专利技术的方法中，从包括靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA。该病毒可以是病毒颗粒。即，在一个优选实施例中，该方法用于从包括靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒颗粒和/或病毒DNA。在一个更优选实施例中，该方法用于从包括靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒DNA。该病毒可以是一种传染性病毒，例如一种发现于猪来源的传染性病毒。该病毒可以是一种DNA病毒，例如单链DNA病毒，如一种具有单链DNA和环状DNA的病毒。该病毒可以是一种RNA病毒。该病毒可以是一种无包膜病毒，例如一种小的无包膜病毒。它可以是一种无包膜DNA病毒或无包膜RNA病毒。该病毒可以是一种在真核细胞中自主复制的病毒。在一个优选实施例中，该病毒是一种无包膜DNA病毒，例如一种小的无包膜DNA病毒。该病毒可以选自下组，该组由以下各项组成：PCV2(猪环状病毒2)、PCV1(猪环状病毒1)、PPV(猪细小病毒)、EMCV(猪脑心肌炎病毒)、HEV(猪戊型肝炎病毒)以及SVDV(猪水疱病病毒)。在一个优选实施例中，该病毒是PCV2。在本专利技术的方法的步骤a)中，将丙酮以选择性地沉淀该病毒和/或病毒DNA的浓度添加至包括该靶蛋白的溶液中。它可以是包括沉淀的病毒DNA或与其相关的病毒颗粒。和/或它可以本身是病毒DNA，例如沉淀的游离病毒DNA。选择性沉淀意指大部分的病毒和/或病毒DNA(即多于50％)被沉淀，同时少于50％的靶蛋白被沉淀。优选地，在步骤a)中，至少60％，例如至少70％、至少80％或至少90％的病毒DNA被沉淀。更优选地，在步骤a)中，至少95％，例如至少99％或至少99.9％的病毒DNA被沉淀。优选地，在步骤a)中，少于40％，例如少于30％的靶蛋白被沉淀。更优选地，在步骤a)中，少于25％，例如少于20％、少于10％或少于5％的靶蛋白被沉淀。本领域技术人员将知道如何确定有待在步骤a)中使用的丙酮的浓度。在一个优选实施例中，在步骤a)中的丙酮的浓度是约12％-40％(v/v)，优选是约12％-30％(v/v)，更优选是约14％-30％(v/v)，甚至更优选是约15％-20％(v/v)。在一个更优选实施例中，该靶蛋白是胰蛋白酶并且在步骤a)中的丙酮的浓度是约12％-40％(v/v)，优选是约12％-30％(v/v)，更优选是约14％-30％(v/v)，甚至更优选是约15％-20％(v/v)。在一个甚至更优选实施例中，该靶蛋白是胰蛋白酶，该病毒是PCV2并且在步骤a)中的丙酮的浓度是约12％-40％(v/v)，优选是约12％-30％(v/v)，更优选是约14％-30％(v/v)，甚至更优选是约15％-20％(v/v)。优选地，在低于15℃的温度下进行步骤a)中的选择性沉淀。在本专利技术的方法中的步骤b)是一个分离步骤，其中将已经在步骤a)中沉淀的材料与包括该靶蛋白的溶液分离。可以通过本领域已知的任何方法进行这样的分离。分离可以包括过滤和/或离心。在一个优选实施例中，在步骤b)中的分离包括深层过滤。优选地，在步骤b)中，至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的病毒DNA被分离。更优选地，在步骤b)中，至少95％，例如至少9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从包括一种靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括：a)将丙酮以选择性地沉淀该病毒和/或病毒DNA的浓度添加至该溶液中，b)进行一个分离步骤，以将沉淀的材料与包括该靶蛋白的溶液分开，c)向该溶液中添加另外量的丙酮，以达到沉淀该靶蛋白的终浓度，并且d)从该溶液中收集该沉淀的靶蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.20 EP 11194674.51.一种用于从包括一种靶蛋白的水溶液中选择性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括：a)将丙酮以选择性地沉淀该病毒和/或病毒DNA的浓度添加至该溶液中，b)进行一个分离步骤，以将沉淀的材料与包括该靶蛋白的溶液分开，c)向该溶液中添加另外量的丙酮，以达到沉淀该靶蛋白的终浓度，并且d)从该溶液中收集该沉淀的靶蛋白，其中，在步骤a)中的丙酮的浓度是12％-40％(v/v)，所述靶蛋白是胰蛋白酶。2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中的丙酮的浓度是12％-30％(v/v)。3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中的丙酮的浓度是14％-30％(v/v)。4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中的丙酮的浓度是15％-20％(v/v)。5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中的丙酮的浓度是15％(v/v)。6.如以上权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的丙酮的终浓度是45％-95％(v/v)。7.如以上权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤c)中的丙酮的终浓度是60％-70％(v/v)。8.如以上权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·约翰森，C·J·克普卡，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK