一种测定三聚氰胺的电化学方法技术

本发明专利技术涉及一种测定三聚氰胺的电化学方法，其特征是用富含胸腺嘧啶(T)的巯基DNA修饰金电极，以富含胸腺嘧啶的DNA和二茂铁修饰的金纳米粒子(Au-Fc-DNA2)为探针，在目标物三聚氰胺存在时，Au-Fc-DNA2与金电极表面的DNA作用，然后通过电化学检测得电化学信号，根据电化学信号实现三聚氰胺的测定。该方法具有高灵敏度，高选择性，低成本，操作简单等特点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，其特征是用富含胸腺嘧啶(T)的巯基DNA修饰金电极，以富含胸腺嘧啶的DNA和二茂铁修饰的金纳米粒子(Au-Fc-DNA2)为探针，在目标物三聚氰胺存在时，Au-Fc-DNA2与金电极表面的DNA作用，然后通过电化学检测得电化学信号，根据电化学信号实现三聚氰胺的测定。该方法具有高灵敏度，高选择性，低成本，操作简单等特点。【专利说明】—种测定三聚氰胺的电化学方法
本专利技术属于电化学
，以金纳米粒子为标记物和二茂铁作为信号分子对三聚氰胺含量进行检测。具体涉及。
技术介绍
食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的是凯氏定氮法。原理是:蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，就可以算出蛋白质的含量。所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，显然，如果样品中还有其它含有氮的化合物，这个方法就不准确了。在通常情况下食物的主要成分中只有蛋白质含有氮，其它主要成分(如碳水化合物、脂肪)都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果样品中有其它含氮物质，通过凯氏定氮法测得的蛋白质含量就会不准确。三聚氰胺(Melamine)是一种化工原料，由于其含氮量高(66.6%)且价格低廉，因此三聚氰胺经常被不法商家添加到食品中，从而提升食品检测中的蛋白质含量指标。但是三聚氰胺是一种有毒的物质，若人体长期摄入三聚氰胺则会造成生殖、泌尿系统的损害，使膀胱、肾部产生结石，并可进一步诱发膀胱癌。目前发展的三聚氰胺检测方法包括:酶联免疫法(ChoiJ H, Kim Y T, Lee JH.Rapid quantification of melamine in milk using competitivel, 1' -oxalyldiimidazole chemiluminescent enzyme immunoassay.Analyst, 2010，135(9):2445)，液相色谱法(Karbiwnyk CM，Andersen W C，Turnipseed S B.Determination of cyanuric acid residuesin catfish，trout，tilapia，salmon and shrimp by liquid chromatography-tandemmass spectrometry.Analytica Chimica Acta, 2009, 637 (1-2): 101),气相色谱法(LiJj Qi H Yj Shi Y P.Determination of melamine residues in milk products by zirconiahollow fiber sorptive microextraction and gas chromatography-mass spectrometry.Journal of Chromatography A，2009，1216:1873)，质谱(Huang G M，Ouyang Z，CooksR G.High-throughput trace melamine analysis in complex mixtures.ChemicalCommunications, 2009，(5):556)和表面增强拉曼光谱法(Hu H B, Wang Z H，PanL.Ag-coated Fe304@Si02three-ply composite microspheres: synthesis,characterization，and application in detecting melaminewith their surface-enhanced ramanscattering.The Journal of Physical Chemistry C，2010，114(17):7738)。最近，电化学方法也被用来对三聚氰胺进行检测(Xu Q, Wei H P，Du S，Li H B，Ji Z P，Hu X Y.Detection ofsubnanomolar melamine based on electrochemical accumulation coupled with enzymecolorimetric assay.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013，61:1810 ；Liao C Wj Chen Y R，Chang J L，Zen J M.Single-run electrochemical determinationof melamine in dairy products and pet foods.Journal of Agricultural andFood Chemistry, 2011，59:9782 ；Liao C Wj Chen Y R，Chang J LjZen J M.A Sensitiveelectrochemical approach for melamine detection using a disposable screen printedcarbon electrode.Electroanalysis, 2011, 23:573 ；Zhang M X, Hu J B.1ndium tinoxide electrode modified by a NH2+ion implantation technique for determination ofmelamine.Electroanalysis, 2013，25:780 ;赵畅，余波，陈振兴，晋冠平.类分子印迹纳米多孔膜修饰电极制备三聚氰胺电化学传感器.食品科学，2012，33:214)。但是，这些方法各有其缺点。本专利技术利用三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以富含胸腺嘧啶的DNA探针作为敏感元件，结合DNA和二茂铁(Fe)修饰的金纳米粒子放大技术，建立了一种对三聚氰胺进行高灵敏度特异性检测的电化学方法，方法具有简单，成本低，灵敏度高的特点。
技术实现思路
本专利技术提供一种特异性检测三聚氰胺含量的方法，利用二茂铁作为信号分子和三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以金纳米粒子，二茂铁和DNA结合物作为探针，用电化学检测法实现了对三聚氰胺含量的测定。技术方案—种测定三聚氰胺的电化学方法，以二茂铁作为信号分子，以金纳米粒子和DNA结合物作为探针，利用三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以电化学检测法测定三取氰胺含量。测定步骤如下:(I)金纳米粒子的制备:制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水(浓盐酸和浓硝酸体积比例为1:3)泡洗30min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；移取IOOmL0.01% HAuC14溶液于烧杯中，在剧烈搅拌下，加热至沸后，快速加入3mL新配制的I %柠檬酸三钠溶液，连续煮 沸，待溶液颜色由深蓝变为红色，即可得到红色的金纳米粒子(Au)溶液。当金纳米粒子溶液冷却至室温后稀释到IOOmL,摇匀，置于4°C冰箱中保存。(2)金纳米粒子探针的制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定三聚氰胺的电化学方法，其特征在于用金纳米粒子为标记物，以二茂铁作为信号分子，实现三聚氰胺测定，测定步骤如下： (1)金纳米粒子的制备：制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水(浓盐酸和浓硝酸体积比例为1:3，泡洗30min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；移取100mL0.01％HAuCl4溶液于烧杯中，在剧烈搅拌下，加热至沸后，快速加入3mL新配制的1％柠檬酸三钠溶液，连续煮沸，待溶液颜色由深蓝变为红色，即可得到红色的金纳米粒子(AuNPs)溶液，当金纳米粒子溶液冷却至室温后稀释到100mL，摇匀，置于4℃冰箱中保存； (2)金纳米粒子探针的制备 a将1mg Fc加入到2mL0.10mol/L NHS和0.10mol/L EDC的磷酸缓冲溶液溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h； b取2mL的样品管，依次加入10μL，10‑4M的巯基乙胺，1mL金纳米粒子溶液，然后在室温下反应12h； c将a和b所得溶液混合，室温下反应24h，即得金纳米粒子探针(Au‑Fc‑DNA2)；最后将洗涤后的Au‑Fc‑DNA2复合物分散在磷酸缓冲溶液中置于4℃冰箱中保存备用； (3)金电极(Gold electrode)的处理：首先将金电极浸泡在Piranha溶液中15min然后在麂皮上分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm氧化铝粉抛光，依次用蒸馏水，乙醇和蒸馏水分别超声5min，最后在0.1M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描直至电流电压曲线稳定；在洁净的金电极表面滴加2μM DNA1，在25℃下组装120min，修饰了DNA1的金电极表面经充分洗净后，用高纯氮气吹干，然后将金电极浸入1mM巯基己醇中，25℃下封闭60min，充分洗净后，用高纯氮气吹干备用； (4)三聚氰胺的测定：将10.0μL不同浓度的三聚氰胺标准溶液或样品溶液和10.0μLAu‑Th‑DNA2复合物溶液滴加到修饰了DNA1的金电极表面，在室温下反应60min，然后，用磷酸缓冲溶液反复冲洗电极表面，除去未结合的三聚氰胺和Au‑Th‑DNA2复合物，以上述所得电极为工作电极，利用差分脉冲伏安法(DPV)在磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为‑0.7～0.1V，根据电化学信号对三聚氰胺进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线； (5)样品分析，取牛奶样品中样品，按步骤(4)方法进行实验，根据电化学信号和步骤(4)所得标准曲线可以获取三聚氰胺含量； 其中，所述的DNA1序列部分为5’‑HS‑CCG CTG CCG GTT TTG GTT CGG‑3’； 其中，所述的DNA2序列部分为5’‑CCG TTC CTT TTC CGG‑HS‑3’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，徐亚琼，康泰，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37