一种定量检测肽段糖基化水平的方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种定量检测肽段糖基化水平的新方法，具体包括凝集素液相悬浮芯片的制备、糖基化蛋白质的酶解、糖基化肽段的检测。该方法克服了高效液相色谱、质谱等传统的糖基化分析手段的技术路线复杂、耗时、耗力的弊端，可以快速、简便、高灵敏、高通量地检测肽段的糖基化水平，使用的样品量较少，有利于不同肽段样品之间的糖基化差异比较，为疾病相关的生物样本中的多肽糖基化分析提供有效手段，有利于探讨内源性肽段的不同糖基化状态对疾病的预测价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属生物
，涉及一种定量检测肽段糖基化水平的新方法，具体包括凝集素液相悬浮芯片的制备、糖基化蛋白质的酶解、糖基化肽段的检测。该方法克服了高效液相色谱、质谱等传统的糖基化分析手段的技术路线复杂、耗时、耗力的弊端，可以快速、简便、高灵敏、高通量地检测肽段的糖基化水平，使用的样品量较少，有利于不同肽段样品之间的糖基化差异比较，为疾病相关的生物样本中的多肽糖基化分析提供有效手段，有利于探讨内源性肽段的不同糖基化状态对疾病的预测价值。【专利说明】
本专利技术属生物
，涉及肽段糖基化水平的检测方法，具体涉及一种新的定量检测肽段糖基化水平的方法。本方法包括凝集素液相悬浮芯片的制备、糖蛋白的酶解、通过凝集素液相悬浮芯片对牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)酶解肽段进行检测。
技术介绍
现有技术公开了蛋白质糖基化是最常见、最重要的翻译后修饰之一。研究显示，糖链会影响糖蛋白的理化性质，比如细胞的折叠、溶解性、聚集以及降解；蛋白质的糖基化还在多种生物过程中发挥着关键的作用，包括受精过程、发育、激素识别以及细胞间的相互作用等。据报道，许多糖蛋白的糖基化变化为疾病的早期诊断以及预后评估提供了重要的信肩、O凝集素芯片技术是一种非常有吸引力的糖链结构分析技术，具有样品处理简单、样品用量少、高通量、高灵敏度，可以定量检测的优点，目前广泛应用于糖基化蛋白质的糖型分析中；有研究报道，液相凝集素芯片技术可进一步提闻凝集素芯片技术的灵敏度和检测通量。肽组学是研究生物体内源性低分子量蛋白质或多肽(low-molecularweightproteinorpolypeptides, LMWP)及其变化规律的科学。作为蛋白质组学的重要分支，多肽组学在临床医学中做出了显著的贡献，如:确定甲状腺癌的早期诊断肽分子标志物；确定胰腺癌诊断分子一血小板因子-4 ;揭示糖尿病肾病的复杂分子机制等。由于糖基化修饰参与了分泌肽的信号转导、通讯与应答等重要的生物过程，因此，对肽段糖基化水平的研究将有助于揭示重要的生命活动以及寻找潜在的疾病诊断标志物。传统的分析手段，如高效液相色谱、毛细管电泳、质谱，用于糖基化分析时，通常比较复杂、耗时、耗力；同时，由于糖基化修饰的肽段在生物样本中表达量很低，阻碍了多肽/低分子量蛋白质的糖基化修饰的研究。本申请的专利技术人拟提供一种快速、高灵敏度、高通量的检测肽段糖链结构和糖基化水平的实用方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供。本方法能快速、高灵敏、高通量的检测糖基化肽段的糖链结构，且可比较不同样本中肽段的糖基化水平，具有很好的临床应用前景。为实现上述目的，本专利技术采用不同于传统的糖基化分析手段的复杂、耗时、耗力的技术路线，克服了高效液相色谱、质谱等的弊端，通过如下的技术方案:制备凝集素液相悬浮芯片、酶解糖基化蛋白质实现快速、高灵敏、高通量糖基化肽段的检测。具体的，本专利技术的，其特征在于，其包括步骤:I)凝集素与磁珠共价偶联，制备凝集素液相悬浮芯片；2)糖蛋白酶解；本专利技术的实施例中以牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)为例，进行糖蛋白的酶解；3)用生物素标记肽段；本专利技术的实施例中，用生物素标记牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的IysC酶解肽段；4)凝集素液相悬浮芯片与生物素标记的肽段反应。本专利技术的实施例中，生物素标记的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段与偶联凝集素的磁珠反应；5)用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对凝集素芯片信号进行采集，并且记录荧光信号中位值(MFI)。本专利技术步骤3)中，采用氨基反应生物素标记试剂盒对肽段进行生物素标记；本专利技术步骤3)中，采用氨基反应生物素标记糖蛋白，于37°C反应15分钟；本专利技术步骤3)中，生物素标记结束后，不需要除去反应液，可以直接继续与凝集素液相悬浮芯片进行反应；本专利技术采用凝集素液相悬浮芯片技术定量检测糖基化肽段的糖基化水平，结果显示，该方法可以快速、简便、高灵敏、高通量地定量检测肽段的糖基化特征，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的差异比较，本专利技术为高通量的肽段糖基化修饰差异谱分析提供新的技术平台，有助于探讨内源性肽标志物的不同糖基化状态对疾病的预测价值。本专利技术的定量检测肽段糖基化水平的方法的优点有:1，该方法克服了高效液相色谱、质谱等传统的糖基化分析手段的技术路线复杂、耗时、耗力的弊端；2、能快速、简便、高灵敏、高通量地检测肽段的糖基化水平；3、使用的样品量较少；4、有利于不同肽段样品之间的糖基化差异比较；5、为疾病相关的生物样本中的多肽糖基化分析提供有效手段，有利于探讨内源性肽段的不同糖基化状态对疾病的预测价值。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。【专利附图】【附图说明】图1为本方法的实验流程示意图。图2为凝集素RCA120检测牛去唾液酸化胎球蛋白糖基化肽段的最低检测限。图3为凝集素RCA120检测牛去唾液酸化胎球蛋白糖基化肽段的线性范围。【具体实施方式】实施例1采用下述步骤定量检测肽段糖基化水平I)凝集素与磁珠共价偶联，制备凝集素液相悬浮芯片；用清洗缓冲液(偶联试剂盒自带)清洗磁珠后，加入活化缓冲液(偶联试剂盒自带)重悬磁珠，向磁珠内加入50 μ g/μ LEDC和50 μ g/μ Lsulf0-NHS振荡条件下避光室温反应20分钟，用PBS清洗过量的EDC和sulfo-NHS，并重复清洗过程一次，最后，用PBS重悬活化的磁珠，用PBS配置的凝集素与活化后的磁珠4°C过夜反应，离心去上清后，加入“StabilGuardChoice”无蛋白封闭溶液重悬，室温孵育30分钟，离心后，用贮存缓冲液(偶联试剂盒自带)重悬磁珠；2)糖蛋白酶解，本实施例中，选用对牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的酶解，将牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)溶于H2O,使蛋白终浓度为I μ g/μ L，向蛋白溶液中，加入IM碳酸氢铵，使得蛋白溶液中碳酸氢铵的终浓度为50mM，以蛋白与蛋白酶(IysC)的质量比为50:1，加入lysC，37°C过夜反应；3)用生物素标记肽段，本实施例中，选用生物素标记牛去唾液酸胎球蛋白(ASF)的IysC酶解肽段，将32 μ LDMSO加入到氨基-反应生物素中(标记试剂盒自带)，吹打使其溶解。向IOug酶解肽段中加入26.8 μ L反应溶液(标记试剂盒自带)及3.2 μ L氨基-反应生物素溶液，混匀后，37°C反应15分钟；4)凝集素液相悬浮芯片与生物素标记的肽段反应，本实施例中，对生物素标记的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段与偶联凝集素的磁珠反应，向孵育缓冲液(0.5 % Tween-20PBS)中加入生物素化的牛去唾液酸胎球蛋白IysC酶解肽段和磁珠，4°C下反应过夜，反应结束后，加入100 μ L清洗缓冲液(0.1 %Tween-20PBS)清洗磁珠，再加入50 μ L孵育缓冲液稀释的I μ g/mL链霉素-藻红蛋白室温下振荡反应40分钟，反应结束后，重复清洗步骤，最后，用清洗缓冲液重悬磁珠。5)用Bio-Plex液相悬浮芯片检测系统对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测肽段糖基化水平的方法，其特征在于，其包括步骤：1)凝集素与磁珠共价偶联，制备凝集素液相悬浮芯片；2)糖蛋白酶解；3)用生物素标记肽段；4)凝集素液相悬浮芯片与生物素标记的肽段反应。5)用Bio‑Plex液相悬浮芯片检测系统对凝集素芯片信号进行采集，并且记录荧光信号中位值(MFI)。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏，魏黎明，杨芃原，方盼，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31