基于pI的蛋白质分级制造技术

提供了用于基于pI分级检测并收集分析物，通过电泳和pI分离分析物，和使用pI聚焦和后续的结晶纯化目标分子的方法和装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于Pl的蛋白质分级相关专利申请的交叉引用本申请请求美国临时专利申请编号61/555，564,61/555, 592和61/555，674的优先权，全部于2011年11月4日递交，且均通过引用全文纳入本文用于全部目的。
技术介绍
目前基于等电聚焦的蛋白质/肽分级技术有至少两种缺陷。首先，样品在固定或有限的PH范围内分离，导致各样品的分级效果未能达到最优。其次，样品分级所需的pH梯度是由化学品(两性电解质)建立的，导致经分离的样品受到化学品污染和(潜在的)对下游分析的干扰。
技术实现思路
在一些实施方式中，本专利技术提供了一种分离和检测样品中分析物的装置，所述装置包括用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室，在腔室的轴线的第一末端有样品注射端口且在轴线的第二末端有出口 ；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过双极膜与所述腔室分离的一个或多个离子源，用于通过注射离子流在所述腔室中沿所述轴线建立pH梯度,能够在pH梯度中形成一级或多级pH ;操纵所述一个或多个离子源以调节pH梯度来使得所述分子分析物沿轴线分别迁移的控制器；以及一个或多个出口，以允许通过所述出口将一种或多种分析物收集至容器或分析仪器(如质谱仪或其他检测系统)内。在一些实施方式中，所述一个或多个离子源是质子注射器或氢氧根注射器。在一些实施方式中，本专利技术提供了 一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质(或其他目标分子，包括但不限于核酸)的蛋白质混合物，其中所述腔室包含第一和第二电极以及至少一个位于腔室壁上电极之间的质子注射器或氢氧根注射器，通过双极膜与腔室中的样品分离；使用质子注射器或氢氧根注射器在腔室内产生PH梯度，并施加跨电极的电压，从而基于蛋白质等电点(Pi)对腔室内的蛋白质进行定位；通过与通道流体连通的端口捕获一种或多种蛋白质；并且对一种或多种捕获的蛋白质进行凝胶电泳。在一些实施方式中，所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从电泳凝胶中收集一种或多种蛋白质。在一些实施方式中，本专利技术提供了一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质(或其他目标分子，包括但不限于核酸)的方法，所述方法包括，向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其中所述腔室与一个或多个离子源相连，所述离子源通过双极膜与所述腔室分隔，用于通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度，能够在pH梯度中形成一级或多级pH ;对腔室内蛋白质进行电泳；并且随后使用质子和/或氢氧根注射器在腔室内建立PH梯度，从而基于蛋白质等电点(pi)对腔室内的蛋白质进行定位。在一些实施方式中，在产生pH梯度期间继续进行电泳。在一些实施方式中，所述从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法也包括收集一种或多种目标蛋白质。在一些实施方式中，本专利技术提供了一种同时根据等电点和电泳迁移率分离多种分子分析物的装置，所述装置包括，用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室，其中所述腔室包含一个或多个与腔室流体连通的端口，端口可位于腔室内以根据分析物的Pl捕获所需的分析物，或者能够移动以将一个或多个端口定位在一个或多个所需的位置处；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立PH梯度、且能够在PH梯度中形成一级或多级pH的一个或多个质子/氢氧根源；操纵所述一个或多个离子源以调节PH梯度来使得所述分子分析物沿轴线分别迁移的控制器；以及一个或多个与所述一个或多个端口流体连通的电泳通道，从而允许对所述一个或多个端口中捕获的分析物进行电泳。在一些实施方式中，所述质子或氢氧根源是通过双极膜与腔室分隔的质子注射器或氢氧根注射器。在一些实施方式中，本专利技术提供了一种同时根据等电点和电泳迁移率分离多种分子分析物的装置，所述装置包括，用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室；用于在腔室内沿轴线施加电场的电源；通过注射离子流在所述腔室内沿所述轴线建立pH梯度、且能够在pH梯度中形成一级或多级pH的一个或多个质子/氢氧根源；操纵所述一个或多个离子源以调节PH梯度来沿轴线分别迁移和捕获所述分子分析物的控制器。在一些实施方式中，所述质子或氢氧根源是通过双极膜与腔室分隔的质子注射器或氢氧根注射器。在一些实施方式中，所述腔室包含适用于电泳的筛分介质。在一些实施方式中，所述腔室包含一个或多个与腔室流体连通的端口并且端口位于腔室中以根据分析物的Pl捕获所需的分析物，或者端口能够移动以将一个或多个端口定位在一个或多个所需的位置处。在一些实施方式中，本专利技术提供了一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，所述方法包括，向腔室中加入样品，所述样品含有包含所述目标蛋白质的蛋白质混合物；使用质子和/或氢氧根注射器在腔室中产生PH梯度，从而基于蛋白质等电点(pi)对腔室内的蛋白质进行定位；收集所述目标蛋白质，从而从混合物的其他组分中纯化所述目标蛋白质；以及捕获后对所述蛋白质进行结晶。在一些实施方式中，通过与通道流体连通的端口收集所述目标蛋白质。在一些实施方式中，通过与通道流体连通的多个端口收集多种目标蛋白质。【附图说明】图1A和IB分别显示了质子和氢氧根注射器，包含与通道/腔室相邻的一个小隔室，其中浸有Pt电极，以及将隔室与通道/腔室分隔的双极膜。图2显示了可能的电解质及其与质子注射器的相互作用。应当意识到，使用氢氧根注射器可提供类似的相互作用。图3就质子/氢氧根注射器装置显示了一种实施方式。图4显示了在质子注射器或氢氧根注射器装置中使用的集成式一次性通道的实施方式。可按需要设置用于使流体接触质子/氢氧根注射器隔室的狭缝。例如，在一些实施方式中，腔室中的狭缝为1-1000微米，在一些实施方式中约100微米。可按需要设计狭缝的数量和大小以建立多级PH梯度。如图4所示，任选例如纤维素或其他亲水膜，作用是覆盖未使用的狭缝和/或可任选覆盖双极膜，覆盖程度是使得样品组分与双极膜之间存在亲和力。在一些实施方式中，可使用亲水涂料代替亲水膜覆盖双极膜并阻止样品组分与之结合。此外，还有狭缝可用于将样品提取出或注射入通道。图5A-C显示了 pH分级梯度的产生和使用该梯度分离目标分子。图中，双极膜(2)产生了一个大的PH差异，从而使样品中不需要的组分(I)远离目标分析物聚焦。第二双极膜(4)以目标分析物(3)的pi为中心建立了较小的pH差异。可任选地在腔室中的通道(5)内收集目标分析物(3)。图6显示了 pH分级梯度的产生和使用该梯度分离多种目标分子。该实施方式可用于后续应用，进行电泳或其他应用。图7显示了 pH分级梯度的产生和使用该梯度分离目标分子。这可用于例如蛋白质清除、捕获和直接注射入质谱(MS)或其他检测方法。图8A-D显示了使用PH梯度分离和收集目标分子。图9显示的实施方式中，本文所述腔室或通道适用于将分析物输送至质谱(图9A)或光源(图9B)。图10A-C显示了对目标分子进行的数字pH分析分离。图11显示了在一个维度中基于两种分离标准对分子进行分离的实施方式。图11显示了图中从顶部至底部运行的同一通道在四个时间点(a)、(b)、(c)和⑷的情况。通道左侧的数字表示PH，在沿通道每个显示有pH的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法，所述方法包括，向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其特征在于，所述腔室包含第一和第二电极和位于所述腔室壁上所述电极之间并通过双极膜与所述腔室中的所述样品分离的至少一个质子注射器或氢氧根注射器；使用所述质子注射器或氢氧根注射器在所述腔室内产生pH梯度，并跨越所述电极施加电压，从而使所述腔室内的蛋白质基于所述蛋白质的等电点(pI)来定位；在与通道流体连通的端口捕获一种或多种蛋白质；以及对所述一种或多种捕获的蛋白质进行凝胶电泳。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.04 US 61/555,592;2011.11.04 US 61/555,564;1.一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法，所述方法包括， 向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其特征在于，所述腔室包含第一和第二电极和位于所述腔室壁上所述电极之间并通过双极膜与所述腔室中的所述样品分离的至少一个质子注射器或氢氧根注射器； 使用所述质子注射器或氢氧根注射器在所述腔室内产生pH梯度，并跨越所述电极施加电压，从而使所述腔室内的蛋白质基于所述蛋白质的等电点(Pi)来定位； 在与通道流体连通的端口捕获一种或多种蛋白质；以及 对所述一种或多种捕获的蛋白质进行凝胶电泳。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括从所述电泳凝胶中收集所述一种或多种蛋白质。4.一种分离并检测样品中分析物的装置，所述装置包括， 用于沿一条轴线盛放含多种分子分析物的溶液的腔室，在所述腔室的轴线的第一末端含有一个样品注射端口且在所述轴线的第二末端含有一个出口 ； 用于在所述腔室内 沿所述轴线施加电场的电源； 通过双极膜与所述腔室分离的一个或多个离子源，用于通过注射离子流在所述腔室中沿所述轴线建立pH梯度,能够在一个pH梯度中形成一级或多级pH ； 操纵所述一个或多个离子源以调节所述pH梯度来引起所述分子分析物沿轴线分别迁移的控制器；以及 一个或多个出口，允许通过所述出口将一种或多种分析物收集至容器或分析仪器如质谱或其他检测系统内。5.一种从样品中分离一种或多种目标蛋白质的方法，所述方法包括， 向腔室中加入样品，所述样品含有包含一种或多种目标蛋白质的蛋白质混合物，其特征在于，所述腔室连有通过双极膜与所述腔室分隔的一个或多个离子源，用于通过注射离子流在所述腔室内沿轴线建立pH梯度,能够在pH梯度中形成一级或多级pH ； 对所述腔室内的蛋白质进行电泳；以及 随后使用质子和/或氢氧根注射器在所述腔室内产生PH梯度，从而使所述腔室内的蛋白质基于所述蛋白质的等电点(Pl)来定位。6.如权利要求5所述方法，其特征在于，在所述pH梯度建立期间继...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·保勒斯，C·迪吉斯，R·保格弗，S·班德卡维，A·哈恩温德加森，A·珀什，E·布罗德，U·司旺，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，泰克尼翁研究发展基金有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US