本发明专利技术公开了一种总PSA和游离PSA二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法，该方法用一株抗PSA抗体包被成固相包被板，用两种不同的酶来标记PSA不同位点的抗体，再用不同酶对应的不同底物来获取各自的标准曲线进而实现在一次免疫反应过程中同时检测PSA和FPSA两种物质的浓度。采用此发明专利技术前的检测总PSA和游离PSA是通过两次实验分别进行的，操作繁琐，时间周期长。采用本发明专利技术后能将两种检测试剂二合一，通过一次实验获得两种项目的结果，缩短的实验时间，减少实验步骤。
【技术实现步骤摘要】
总PSA和游离PSA 二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法
本专利技术涉及一种医疗设备及其制造方法。
技术介绍
目前国内外对于总前列腺特异性抗原(PSA)和游离前列腺特异性抗原(FPSA)的检测往往是分别进行的。PSA在血清中主要有两种存在形式:一种是游离的PSA(FPSA)，约占血清PSA总浓度的10%~30%。另一种是与α?-抗糜蛋白酶(ACT)结合的PSA(PSA-ACT)，约占血清PSA总浓度的70%~90%。在采用化学发光免疫诊断方法检测时往往采用夹心法，用一株抗体包被，另一株抗体标记上示踪物。在具体检测PSA和游离PSA时，一般采用同一株抗体作为包被抗体，这株抗体既能够跟PSA结合又能够跟FPSA结合，当需要检测的是PSA时就用另一株抗体作夹心反应，这时要求这一株抗体能够与PSA-ACT中暴露在外的PSA位点结合。如果需要检测FPSA时则相反，这时作为夹心的这株抗体必须不能跟PSA-ACT暴露在外的PSA位点结合而应该与其内包的PSA位点结合。在这种情况下，由于PSA-ACT的内包位点的空间位阻，导致仅能跟体液中游离的PSA上的位点结合，这样就达到了仅检测FPSA的目的。这就为本专利技术提供了一种可能性，即通过采用两株针对不同反应位点的抗体作为示踪抗体，其中 一株是仅能够与PSA-ACT的内包位点结合，另一株仅能够与PSA-ACT的外露位点结合，而这两株抗体分别采用不同的示踪剂，就可以区分出PSA与FPSA的量的多少了。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种总PSA和游离PSA 二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法。本专利技术的方法用一株抗PSA抗体包被成固相包被板，用两种不同的酶来标记PSA不同位点的抗体，再用不同酶对应的不同底物来获取各自的标准曲线进而实现在一次免疫反应过程中同时检测PSA和FPSA两种物质的浓度。采用此专利技术前的检测总PSA和游离PSA是通过两次实验分别进行的，操作繁琐，时间周期长。采用本专利技术后能将两种检测试剂二合一，通过一次实验获得两种项目的结果，缩短的实验时间，减少实验步骤。本专利技术的总PSA和游离PSA二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法包括如下步骤:步骤1:取0.5~1.5mg抗PSA包被抗体用0.05Μ、ρΗ9.6的碳酸缓冲液稀释成4~6 μ g/ml,在96孔化学发光板上每孔加100~120 μ I ；4 □静置过夜,次日将板子拍杆，加入含有I %牛血清白蛋白的溶液150~250 μ 1，37°C封闭反应0.5~1.5小时；将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装；优选地，在步骤I中，取Img抗PSA包被抗体用0.05M、pH9.6的碳酸缓冲液稀释成5 μ g/ml,在96孔化学发光板上每孔加ΙΙΟμ I ;4°C静置过夜,次日将板子拍杆,加入含有1%牛血清白蛋白的溶液200μ 1，37°C封闭反应I小时；将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装；步骤2:取0.5?1.5mg抗PSA单抗和0.5?1.5mg辣根过氧化物酶溶解于0.5?1.5ml,0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺0.05?0.15mg ;室温搅拌0.5?1.5小时；取出反应液对0.02M、pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2?4次；优选地，在步骤2中，取Img抗PSA单抗和Img辣根过氧化物酶溶解于Iml、0.IMPH8.0的磷酸缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺0.1mg0室温搅拌I小时；取出反应液对0.02MPH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液3次；步骤3:取0.5?1.5mg抗PSA单抗和0.5?1.5mg碱性磷酸酶溶解于0.5?1.5ml,0.1M、pH6.0的柠檬酸缓冲液中，加入4%戊二醛0.05?0.15ml，室温搅拌0.5?1.5小时，加入0.05?0.15mg赖氨酸终止反应，室温继续搅拌10?20分钟，取出反应液对0.02M、pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2?4次；用含有0.2%牛血清白蛋白的0.1Μ、ρΗ7.4的Tris-HCl缓冲液将步骤2和步骤3反应液混合稀释900?1100倍，10毫升分装备用；优选地,在步骤3中，取Img抗PSA单抗和Img碱性磷酸酶溶解于1ml、0.1M pH6.0的柠檬酸缓冲液中，加入4%戊二醛0.1ml，室温搅拌I小时，加入0.1mg赖氨酸终止反应，室温继续搅拌15分钟，取出反应液对0.02M pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液3次；用含有0.2 %牛血清白蛋白的0.1ΜρΗ7.4的Tris-HCl缓冲液将步骤2和步骤3反应液混合稀释1000倍，10毫升分装备用；步骤4:分别量取90?IlOml已灭活过的新生牛血清4?6份，分别往每份血清中添加总PSA标准品原料和游离PSA标准品原料，混合均匀后将配制的血清样品用罗氏电化学发光系统分别标定总PSA浓度值和游离PSA浓度值，分装后作为试剂盒的系列校准品；优选地,在步骤4中，分别量取IOOml已灭活过的新生牛血清5份；步骤5:分别采用市售的金刚烷化学发光底物系统和鲁米诺化学发光底物系统作为发光底物；金刚烷系统化学发光底物每个试剂盒4?8毫升，鲁米诺化学发光底物系统又分为A液、B液两个组分,其中A液为鲁米诺溶液,4?8毫升；B液为氧化剂溶液,4?8毫升;优选地，金刚烷系统化学发光底物每个试剂盒6毫升，鲁米诺化学发光底物系统又分为A液、B液两个组分,其中A液为鲁米诺溶液,6毫升；B液为氧化剂溶液,6毫升；步骤6:配制含有0.05% TWEEN20的0.0lM pH7.4的Tris-HCl缓冲液为洗涤液。通过使用本专利技术，可以使得医疗检验机构的可以使用一个试剂盒同时检测两种指标，操作时间缩短一半，操作步骤减少一半。患者可以更快获得检验结果。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过具体实施例对本专利技术的制备方法进一步详细说明。实施例1:取Img抗PSA包被抗体用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液稀释成5 μ g/ml，在96孔化学发光板上每孔加ΙΙΟμ I。4°C静置过夜，次日将板子拍杆，加入含有1%牛血清白蛋白的溶液200μ 1，37°C封闭反应I小时。将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装。取Img抗PSA(PSA-ACT内包位点)单抗和Img辣根过氧化物酶溶解于lml、0.1MPH8.0的磷酸缓冲液(P.B)中，加入水溶性碳二亚胺(EDC)0.1mgo室温搅拌I小时。取出反应液对0.02M pH7.4的P.B透析过夜，中间换液3次。取Img抗PSA (PSA-ACT外露位点)单抗和Img碱性磷酸酶溶解于Iml、0.IM pH6.0的柠檬酸缓冲液中，加入4%戊二醛0.1ml，室温搅拌I小时，加入0.1mg赖氨酸终止反应，室温继续搅拌15分钟，取出反应液对0.02M pH7.4的P.B透析过夜，中间换液3次。取出反应液并与前一步制备的辣根酶标记物反应液混合并用含有0.2%牛血清白蛋白的0.1MPH7.4的Tris-HCl缓冲液将步骤2和步骤3反应液混合稀释1000倍，10毫升分装后作为标记物工作液备用。分别量取IOOml已灭活过的新生牛血清5份，分别往每份血清中添加一定量的总PSA标准品原料和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种总PSA和游离PSA二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤1：取0.5～1.5mg抗PSA包被抗体用0.05M、pH9.6的碳酸缓冲液稀释成4～6μg/ml，在96孔化学发光板上每孔加100～120μl；4℃静置过夜，次日将板子拍杆，加入含有1％牛血清白蛋白的溶液150～250μl，37℃封闭反应0.5～1.5小时；将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装；步骤2：取0.5～1.5mg抗PSA单抗和0.5～1.5mg辣根过氧化物酶溶解于0.5～1.5ml、0.1M、pH8.0的磷酸缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺0.05～0.15mg；室温搅拌0.5～1.5小时；取出反应液对0.02M、pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2～4次；步骤3：取0.5～1.5mg抗PSA单抗和0.5～1.5mg碱性磷酸酶溶解于0.5～1.5ml、0.1M、pH6.0的柠檬酸缓冲液中，加入4％戊二醛0.05～0.15ml，室温搅拌0.5～1.5小时，加入0.05～0.15mg赖氨酸终止反应，室温继续搅拌10～20分钟，取出反应液对0.02M、pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2～4次；用含有0.2％牛血清白蛋白的0.1M、pH7.4的Tris‑HCl缓冲液将步骤2和步骤3反应液混合稀释900～1100倍，10毫升分装备用；步骤4：分别量取90～110ml已灭活过的新生牛血清4～6份，分别往每份血清中添加总PSA标准品原料和游离PSA标准品原料，混合均匀后将配制的血清样品用罗氏电化学发光系统分别标定总PSA浓度值和游离PSA浓度值，分装后作为试剂盒的系列校准品；步骤5：分别采用市售的金刚烷化学发光底物系统和鲁米诺化学发光底物系统作为发光底物；金刚烷系统化学发光底物每个试剂盒6毫升，鲁米诺化学发光底物系统又分为A液、B液两个组分，其中A液为鲁米诺溶液，6毫升；B液为氧化剂溶液，6毫升；步骤6：配制含有0.05％TWEEN20的0.01M pH7.4的Tris‑HCl缓冲液为洗涤液。...
【技术特征摘要】
1.一种总PSA和游离PSA 二合一化学发光免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤: 步骤1:取0.5~1.5mg抗PSA包被抗体用0.05M、pH9.6的碳酸缓冲液稀释成4~6μg/ml,在96孔化学发光板上每孔加100~120 μ I ;4°C静置过夜,次日将板子拍杆,加入含有1 %牛血清白蛋白的溶液150~250 μ 1，37°C封闭反应0.5~1.5小时；将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装； 步骤2:取0.5~1.5mg抗PSA单抗和0.5~1.5mg辣根过氧化物酶溶解于0.5~1.5ml,0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺0.05~0.15mg ;室温搅拌0.5~1.5小时；取出反应液对0.02M、pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2~4次； 步骤3:取0.5~1.5mg抗PSA单抗和0.5~1.5mg碱性磷酸酶溶解于0.5~1.5ml、0.1Μ、ρΗ6.0的柠檬酸缓冲液中，加入4%戊二醛0.05~0.15ml，室温搅拌0.5~1.5小时，加入0.05~0.15mg赖氨酸终止反应，室温继续搅拌10~20分钟，取出反应液对0.02M、PH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液2~4次；用含有0.2%牛血清白蛋白的0.1M、PH7.4的Tris-HCl缓冲液将步骤2和步骤3反应液混合稀释900~1100倍，10毫升分装备用; 步骤4:分别量取90~IlOml已灭活过的新生牛血清4~6份，分别往每份血清中添加总PSA标准品原料和游离PSA标准品原料，混合均匀后将配制的血清样品用罗氏电化学发光系统分别标定总PSA浓度值和游离PSA浓度值，分装后作为试剂盒的系列校准品； 步骤5:分别采用市售的金刚烷化学发光底物系统和鲁米诺化学发光底物系统作为发光底物；金刚烷系统化学发光底物每个试剂盒6毫升，鲁米诺化学发光底物系统又分为A液、B液两个组分，其中A液为鲁米诺溶液，6毫升；B液为氧化剂溶液，6毫升； 步骤6:配制含有0.05% TWEEN20的0.01M ρΗ7.4的Tris-HCl缓冲液为洗涤液。2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，在步骤I中，取Img抗PSA包被抗体用0.05Μ、ρΗ9.6的碳酸缓冲液稀释成5 μ g/ml，在96孔化学发光板上每孔加IlOy I ;4°C静置过夜，次日将板子拍杆，加入含有I %牛血清白蛋白的溶液200 μ 1，37°C封闭反应I小时；将板子再次拍干，置于烘干间抽湿烘干后真空包装。3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，在步骤2中,取Img抗PSA单抗和Img辣根过氧化物酶溶解于Iml、0.1M pH8.0的磷酸缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺0.1mg0室温搅拌I小时；取出反应液对0.02M pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜，中间换液3次。4...
【专利技术属性】
技术研发人员：林斯，
申请(专利权)人：林斯，
类型：发明
国别省市：北京;11
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