本发明专利技术公开了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，该方法为先从样品中提取病毒DNA；以病毒DNA为模板，利用所设计的特异性引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物；最后对扩增产物进行HRM分析，确定犬细小病毒的基因型。本发明专利技术操作简单，只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
—种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法
本专利技术涉及病毒基因分型的方法，具体涉及一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法。
技术介绍
犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)为单链小DNA病毒，是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977年，Eugster和Nairn首次从患出血性肠炎的病犬的粪便中分离到犬细小病毒，并命名为CPV-2。自Eugster等人首次分离获得CPV-2以来，CPV抗原性随时间的推移而不断发生改变，不断有新的CPV基因型和抗原型出现，并在世界范围内广泛传播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV-2a、CPV-2b和CPV_2c，而原始型CPV-2基因型已被新出现的抗原变异株取代。CPV-2a、CPV_2b和CPV_2c三种基因型核酸序列差异主要体现在VP2基因序列上2个单核苷酸多肽性(SNP)位点上，第一个SNP位点为A4062G，分别对应CPV-2a (AAT)和CPV_2b (GAT)。第二个SNP位点为T4064A，分别对应 CPV-2b (GAT)和 CPV-2c (GAA)。传统的各种基因分型方法都存在各自的不足之处，如病毒分离与鉴定方法需借助3种不同单克隆抗体才能完成分型，费时费力不易快速区分犬细小病毒不同基因型；血凝抑制试验方法对犬细小病毒梯度要求较高，一般梯度大于1:64才可用相应单克隆抗体来鉴别，而梯度小于1:32则需通过在MDCK或F81细胞上扩增后方能用单克隆抗体来检测；而普通PCR方法特异性不高，荧光定量PCR方法(MGB探针)虽然能准确区分犬细小病毒不同基因型，但同时需要两对探针价格昂贵，限制其在生产中的实际应用等等。传统的CPV分型方法有病毒分离与鉴定(VI)、血凝抑制试验(HI)、普通PCR方法、限制性片段长度多态性(RFLP)方法、MGB探针方法和测序等，其中病毒分离与鉴定方法需借助3个不同型单克隆抗体才能完成分型，费时费力不易快速鉴别CPV不同亚型；血凝抑制试验方法对CPV病毒梯度要求较高，一般梯度大于1:64才可用相应单克隆抗体来鉴别，而梯度小于1:32则需通过在MDCK或F81细胞上扩增后方能用单克隆抗体来检测；PCR方法利用CPV-2b序列引物3 '末段碱基错配方式区分CPV-2a和CPV_2b型，此方法虽然能区分CPV-2a和CPV-2b型，但特异性不高容易同时扩增出两个型。此外，新出现的CPV变异株表明3 ,末段碱基错配法保守性差，易受到病毒核酸序列突变影响，因此普通PCR方法很难对CPV进行准确分型；限制性片段长度多态性方法能够区分CPV-2b和CPV-2c型，但区分不了 CPV-2a和CPV-2b型，因为Mbo II酶对CPV_2a和CPV_2b酶切结果相同，此方法只能在用单克隆抗体确认为CPV-2b的前体下才能鉴别CPV-2b和CPV-2c基因型；MGB探针方法虽然能够区分CPV不同基因型，但同时合成两个或以上探针，价格昂贵不易在临床检测中使用；测序方法虽然准确率高，但价格偏高所需时间长，一般要24小时才能完成。上述方法均未能克服操作复杂、费时、费用高等缺点，在临床实践中的应用受限。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的犬细小病毒基因分型方法。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术建立了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于在临床实践中推广应用。本专利技术的目的在于提供一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物。本专利技术的另一目的在于提供一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法。本专利技术所采取的技术方案是: 一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示: 引物 Pl:CCAGAAGGAGATTGGATTCA (SEQ ID NO:I)或其核苷酸互补序列， 引物 P2:TTAATGCAGTTAAAGGACCAT (SEQ ID NO:2)或其核苷酸互补序列。一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法，包括以下步骤: O从样品中提取病毒DNA ； 2)以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物； 3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。进一步的，步骤2)中的扩增反应体系为:Premix Ex-Taq 5 μ I 引物 Pl 0.4μ I 引物 Ρ2 0.4μ I 模板 0.8 μ I LC green 染料 I μ I ddH20 至 10 μ I。进一步的，步骤2)中的扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s ;循环 35 次；72°C终延伸 8min ;90°C变性 lmin，30°C杂交 2min，68°C到80°C以0.3°C /步的速率进行熔解曲线分析。进一步的，骤3)中所述HRM分析的具体分析过程为:1)若HRM曲线中存在Tm值为73.48±0.10°C的曲线，说明该样品含有基因型为CPV-2a型的犬细小病毒； 2)若HRM曲线中存在Tm值为72.94±0.05°C的曲线，说明该样品中含有基因型为CPV-2b或CPV-2c的犬细小病毒； 3)在上述2)种情况下，往扩增产物中加入以CPV-2bDNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2为引物的PCR产物后，再进行HRM曲线分析: a.若Tm值为72.94±0.05°C的曲线形状不发生变化，说明该样品含有CPV_2b基因型犬细小病毒不含有CPV_2c型病毒； b.若Tm值为72.94±0.05°C的曲线形状发生变化，产生了杂合子曲线，说明该样品含有CPV-2c型犬细小病毒。本专利技术的有益效果是:O本专利技术首次建立了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，操作简单:只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量:全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB ;准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。2)本专利技术的PCR-HRM引物，简并性好，对3种亚型的犬细小病毒均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。3)本专利技术的PCR-HRM引物特异性好，除可以与3种亚型的犬细小病毒结合，不与其他常见犬类病毒DNA结合，特异性扩增犬细小病毒DNA，有利于提高本专利技术对基因型分析的正确性。【附图说明】图1为不同基因型犬细小病毒的HRM高分辨率熔解曲线； 图2为不同基因型犬细小病毒的杂合子HRM高分辨率熔解曲线； 图3为实际样品检测中不同基因型犬细小病毒的HRM高分辨率熔解曲线； 图4为实际样品检测中不同基因型犬细小病毒的杂合子HRM高分辨率熔解曲线； 图5为特异性实验图。【具体实施方式】一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示: 引物 Pl:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR‑HRM引物，其核苷酸序列如下所示：引物P1：CCAGAAGGAGATTGGATTCA（SEQ ID NO：1）或其核苷酸互补序列，引物P2：TTAATGCAGTTAAAGGACCAT（SEQ ID NO：2）或其核苷酸互补序列。
【技术特征摘要】
1.一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示: 引物 Pl:CCAGAAGGAGATTGGATTCA (SEQ ID NO: I)或其核苷酸互补序列， 引物 P2:TTAATGCAGTTAAAGGACCAT (SEQ ID NO:2)或其核苷酸互补序列。2.一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法，其特征在于:包括以下步骤: O从样品中提取病毒DNA ； 2)以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物； 3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤2)中的扩增反应体系为:Premix Ex-Taq 5 μ I 引物 Pl 0.4μ I 引物 Ρ2 0.4μ I 模板 0.8 μ I LC green 染料 I μ I ddH20 至 10 μ I。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤2)中的扩增反应程序为:94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭鹏举，嘎利兵嘎，张建峰，刘志成，朱余军，陈琴苓，
申请(专利权)人：广州博至生物科技有限公司，广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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