镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用，本发明专利技术之镉离子胶体金免疫层析检测试纸条按照以下方法制备而成：（1）抗镉离子单抗的制备和纯化；（2）检测抗原镉-乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白的制备；（3）胶体金溶液的制备；（4）抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备；（5）喷金；（6）硝酸纤维素膜上包被C,T线；（7）镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装。本发明专利技术还包括所述镉离子胶体金免疫层析检测试纸条的应用。本发明专利技术之镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，成本低廉，检测精度高，可大规模地对粮食及其加工产品残留重金属镉进行快速、方便、准确的检测。
【技术实现步骤摘要】
镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用，尤其是涉及一种镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用。
技术介绍
镉以二价离子形式存在于环境中，是水体污染中的主要重金属，进入人体后能引发中毒反应，使肾功能遭到破坏，引起肠胃炎和贫血等症状，骨骼中积累过多镉易引发癌症。WHO对镉的安全标准就是基于对肾脏的毒性建立的，上限是每周每公斤体重7微克。这相当于一个60公斤的人，每天不超过60微克。我国大米的安全标准是每公斤0.2毫克，然而，2013年中国报道的“镉大米”事件中，镉的含量最高可达每公斤1.005毫克，严重超过我国安全生产标准。目前，重金属镉的检测方法主要有: (I)物理和化学方法:原子吸收分光光度法(AAS)、电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)、原子荧光光谱分析(AFS)等。这些方法的特点是灵敏、准确，但是需要复杂的仪器设备，专门的分析技术人员，且标准品价格昂贵，前处理麻烦，不能同时检测大量样品，不适合现场及大规模的推广应用。(2)免疫学检测技术一酶联免疫吸附检测法(ELISA):其检测原理是利用样品中的镉离子与标准品中的镉离子竞争结合抗体并以此对样品中的镉进行定性或定量分析，该方法比较简便快速，可同时处理大量样品。但价格昂贵，单次检测成本高。现有技术中还没有使用胶体金免疫层析法检测食物或水中镉离子的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种镉离子胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用，可大规模地对粮食及其加工产品残留重金属镉进行快速、方便、准确的检测。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是: 本专利技术之镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，按照以下方法制备而成: (I)抗镉离子单抗的制备和纯化:用双功能乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸螯合剂(iEDTA)将镉离子偶联到牛血清蛋白上，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2-4 ml腹水，加入相当于腹水体积1.8 — 2.2倍的醋酸钠缓冲液，调节pH到4.0-5.0,得混合液；于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸与所述混合液的体积比为30-40μ 1/ml ;2-8°C下静置、离心，得到上清液；调节pH到7.0-7.8，2-8°C冷水浴下加入硫酸铵，控制硫酸铵终浓度为0.25-0.30g/ml (优选 0.277 g/ml )，静置 l-2h ;然后 2-8°C、8000-12000r/min 离心 10_20min，弃上清液，将沉淀溶于0.008-0.012mol/L的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)中进行透析，2_8°C静置过夜，8000-12000r/min离心10_20min,弃沉淀；得到抗镉离子单抗； 所述醋酸钠缓冲液的摩尔浓度为0.05-0.08mol/L, pH值为4.5-5.5，所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为0.008-0.012mol/L, pH值为7.0-7.8 ； (2)检测抗原镉-乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸-牛血清蛋白的制备:取乙烯基二胺_N，N，N’，N’ -四乙酸以质量体积比为15 - 25mg/ml溶于二甲基亚砜中形成A液；将兔抗牛血清蛋白以质量体积比为15_16mg/ml溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，分别加入占三羟甲基甲烷盐酸盐体积1-2%的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；将A液逐滴加入B液中，所述A液与B液体积比为1:0.8-1.2，震荡12-24h ;用超滤管离心，得到乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白；取硝酸镉以质量体积比为10-12mg/ml溶于二甲基亚砜中形成C液；将C液逐滴加入到乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白中，乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白与C液的体积比为1:0.8-1.2，震荡2_5h ;用超滤管离心，得到检测抗原镉-乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白； (3)胶体金溶液的制备:取质量浓度为0.008-0.012%的氯金酸水溶液80-120ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8-1.2%的柠檬酸三钠水溶液2-3ml，继续搅拌加热0.5-24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20 - 40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液； (4)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)所得胶体金溶液80-120ml，用摩尔浓度为0.2-0.3mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.3-8.8 ;将步骤(I)所得抗镉离子单抗1.2-2.0mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5 一 24小时；逐滴加入质量浓度为8-12%的无菌牛血清蛋白8-14ml，搅拌0.5 一 24h，4°C 一 30°C静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000 - 14000r/min离心20_60min，弃去上清液，加入摩尔浓度0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液2-6ml重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液； (5)喷金:把步骤(4)所得抗镉离子单抗标记的胶体金溶液按2- 10 μ Ι/cm的喷量喷在结合垫上，37°C — 45°C抽风烘干，时间为5 - 24h，得到喷金后的结合垫； (6)硝酸纤维素膜上包被C，T线:在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2 — 1.5mg/ml ;T线为检测线，包被镉的检测抗原镉-乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白，浓度为0.1 — 0.9mg/ml ;37°C — 45°C抽风烘干，时间为2 - 24h ;得到包被后的硝酸纤维素膜； 所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端; (7)镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装:将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤(5)所喟喷金后的结合垫、步骤(6)所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条； 组装方式如下:以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5 - 24h，取出后于37 - 45°C抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01 - 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液、质量体积比为3g —6g/ (IOOml磷酸盐缓冲液)的非离子表面活性剂、体积比为Iml — 4ml/ (IOOml磷酸盐缓冲液)的吐温20和质量体积比为5g - 20g/ (IOOml磷酸盐缓冲液)的聚乙二醇6000组成的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0 — 7.5 ; 所述非离子表面活性剂优选脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚本文档来自技高网...
【技术保护点】
镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，按照以下方法制备而成： （1）抗镉离子单抗的制备和纯化：用双功能乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸螯合剂将镉离子偶联到牛血清蛋白上，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2‑4 ml腹水，加入相当于腹水体积1.8－2.2倍的醋酸钠缓冲液，调节pH到4.0‑5.0，得混合液；于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸与所述混合液的体积比为30‑40μl/ml；2‑8℃下静置、离心，得到上清液；调节pH到7.0‑7.8，2‑8℃冷水浴下加入硫酸铵，控制硫酸铵终浓度为0.25‑0.30g/ml，静置1‑2h；然后2‑8℃、8000‑12000r/min离心10‑20min，弃上清液，将沉淀溶于0.008‑0.012mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行透析，2‑8℃静置过夜，8000‑12000r/min离心10‑20min，弃沉淀；得到抗镉离子单抗；（2）检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白的制备：取乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸以质量体积比为15－25mg/ml溶于二甲基亚砜中形成A液；将兔抗牛血清蛋白以质量体积比为15‑16mg/ml溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，分别加入占三羟甲基甲烷盐酸盐体积1‑2%的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；将A液逐滴加入B液中，所述Ａ液与Ｂ液体积比为1:0.8‑1.2，震荡12‑24h；用超滤管离心，得到乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白；取硝酸镉以质量体积比为10‑12mg/ml溶于二甲基亚砜中形成C液；将C液逐滴加入到乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白中，乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白与Ｃ液的体积比为1:0.8‑1.2，震荡2‑5h；用超滤管离心，得到检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白；（3）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008‑0.012%的氯金酸水溶液80‑120ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8‑1.2%的柠檬酸三钠水溶液2‑3ml，继续搅拌加热0.5‑24h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20－40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；（4）抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备：取步骤（3）所得胶体金溶液80‑120ml，用摩尔浓度为0.2‑0.3mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.3‑8.8；将步骤（1）所得抗镉离子单抗1.2‑2.0mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5－24小时；逐滴加入质量浓度为8‑12%的无菌牛血清蛋白8‑14ml，搅拌0.5－24h，4℃－30℃静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000－14000r/min离心20‑60min，弃去上清液，加入摩尔浓度0.01‑0.02mol/L的磷酸盐缓冲液2‑6ml重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液；（5）喷金：把步骤（4）所得抗镉离子单抗标记的胶体金溶液按2－10μl/cm的喷量喷在结合垫上，37℃－45℃抽风烘干，时间为5－24h，得到喷金后的结合垫； （6）硝酸纤维素膜上包被C,T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2－1.5mg/ml；T线为检测线，包被镉的检测抗原镉‑乙烯基二胺‑N,N,N’,N’‑四乙酸‑牛血清蛋白，浓度为0.1－0.9mg/ml；37℃－45℃抽风烘干，时间为2－24h；得到包被后的硝酸纤维素膜；所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测T线和质控C线，其中检测线T线靠近样品垫一端； （7）镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤（5）所得喷金后的结合垫、步骤（6）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸组装，切割成条，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条；组装方式如下：以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成；其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面；所述结合垫和样品垫是将聚酯膜经过混合液浸泡5－24h，取出后于37－45℃抽风烘干得到；所述混合液为摩尔浓度为0.01－0.02mol/L的磷酸盐缓冲液、质量体积比为3g－6g/（100ml磷酸盐缓冲液）的非离子表面活性剂、体积比为1ml－4ml/（100ml磷酸盐缓冲液）的吐温20和质量体积比为5g－20g/（100ml磷酸盐缓冲液）的聚乙二醇6000组成的，所...
【技术特征摘要】
1.镉离子胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，按照以下方法制备而成: (1)抗镉离子单抗的制备和纯化:用双功能乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸螯合剂将镉离子偶联到牛血清蛋白上，混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养,注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2-4 ml腹水，加入相当于腹水体积1.8 — 2.2倍的醋酸钠缓冲液，调节PH到4.0-5.0，得混合液；于室温搅拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸与所述混合液的体积比为30-40 μ 1/ml ;2-8°C下静置、离心，得到上清液JfpH到7.0-7.8，2-8°C冷水浴下加入硫酸铵，控制硫酸铵终浓度为0.25-0.30g/ml，静置l_2h ;然后2_8°C、8000-12000r/min离心10_20min，弃上清液，将沉淀溶于0.008-0.012mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行透析，2-8°C静置过夜，8000-12000r/min离心10_20min，弃沉淀；得到抗镉离子单抗； (2)检测抗原镉-乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸-牛血清蛋白的制备:取乙烯基二胺_N，N，N’，N’ -四乙酸以质量体积比为15 - 25mg/ml溶于二甲基亚砜中形成A液；将兔抗牛血清蛋白以质量体积比为15-16mg/ml溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，分别加入占三羟甲基甲烷盐酸盐体积1-2%的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；将A液逐滴加入B液中，所述A液与B液体积比为1:0.8-1.2，震荡12-24h ;用超滤管离心，得到乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白；取硝酸镉以质量体积比为10-12mg/ml溶于二甲基亚砜中形成C液；将C液逐滴加入到乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白中，乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白与C液的体积比为1:0.8-1.2，震荡2_5h ;用超滤管离心，得到检测抗原镉-乙烯基二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸-牛血清蛋白； (3)胶体金溶液的制备:取质量浓度为0.008-0.012%的氯金酸水溶液80-120ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为0.8-1.2%的柠檬酸三钠水溶液2-3ml，继续搅拌加热0.5-24h，直至溶 液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20 - 40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液； (4)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)所得胶体金溶液80-120ml，用摩尔浓度为0.2-0.3mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.3-8.8 ;将步骤(1)所得抗镉离子单抗1.2-2.0mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5 一 24小时；逐滴加入质量浓度为8-12%的无菌牛血清蛋白8-14ml，搅拌0.5 一 24h，4°C 一 30°C静置过夜；将标记后的胶体金溶液于12000 - 14000r/min离心20_60min，弃去上清液，加入摩尔浓度0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液2-6ml重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液； (5)喷金:把步骤(4)所得抗镉离子单抗标记的胶体金溶液按2- 10 μ Ι/cm...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘博，林亲录，罗非君，杨涛，汪龙，肖华西，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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