一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定凝结芽孢杆菌的方法，具体涉及一种新的鉴定凝结芽孢杆菌的分子生物学方法。该方法通过对凝结芽孢杆菌基因特异的DNA序列设计特异性引物：HFQ1/HFQ2，用该引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增检测，可以将凝结芽孢杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明专利技术将为凝结芽孢杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作的实用方法，有利于凝结芽孢杆菌菌株的分类及研究工作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物额鉴定方法，具体涉及，属于分子生物学的
。
技术介绍
凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)呈杆状,两端钝圆,革兰氏阳性菌,过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。最适生长温度为45~50°C,最适pH值为6.6~7.0。其能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀,其除具有乳酸菌和双歧杆菌等保健功效外，还具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性，且具有较强的抑制肠道致病菌能力。在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，但在我国关于凝结芽孢杆菌的研究和开发才刚刚起步。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。综上所述，不论是作为益生菌来利用，还是作为酸败的罪魁祸首，都需要一种快速的鉴定方法，而传统的生化鉴定操作繁琐、检测时间长，已经不能满足各个领域的需求，因而，对凝结芽孢杆菌快速检测的研究是很有必要的。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本专利技术提供一种检测速度快、成本低的快速检测凝结芽孢杆菌到种的PCR方法。本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现:作为本专利技术的第一方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQl序列与SEQ IDN0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。作为本专利技术的第二方面，一种特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),准备对照菌株；(2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和 (3)用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。步骤(2)中，正向引物HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ；反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。步骤(2)中，PCR扩增体系为:20μ1 由 2 μ 110 XBufferwith MgCl2、I μ ldNTP2.5mmol/L、I μ I HFQ11 Ommo I/L、I μ I HFQ2I Ommo I/L、0.I μ I TaqDNAPolymerase5U/ μ 1、I μ I DNA 模板，13.9 μ I ddH20 ；PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min，变性 94°C 35s，退火 50°C 40s，延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。作为本专利技术的第三方面，一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物的用途，其特征在于:用于凝结芽孢杆菌的分子检测。本专利技术的有益效果:1、较传统鉴定凝结芽孢杆菌的16sDNA扩增、测序、比对、生理生化试验等繁杂步骤来说，本专利技术的方法可以直接鉴定出是否是凝结芽孢杆菌，极大程度上节省了实验资源，可用于大规模样品的鉴定凝结芽孢杆菌。2、本专利技术的引物是根据凝结芽孢杆菌特异保守基因而设计的，应用本专利技术的引物HFQ1/HFQ2可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为290bp的凝结芽孢杆菌目的片段。【附图说明】图1为实施例1中HFQ1/HFQ2引物对种细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。M 泳道为标准 DNA markerfOOO。I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。2号泳道为阴性对 照。3-10号泳道分别为含有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA0图2为实施例2中HFQ1/HFQ2引物对不同样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。M 泳道为标准 DNA marker2000。I号泳道为凝结芽孢杆菌的扩增结果。2号泳道为阴性对照。3号泳道为土壤A样品DNA。4号泳道为土壤B样品DNA。5-号泳道为番爺罐头A样品DNA。6号泳道为番爺罐头B样品DNA。【具体实施方式】结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。实施例1实验步骤1、提取凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA,上述菌种来源见表 I。2、以步骤I中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增。PCR 扩增体系为:20μ I 由 2μ 110 X Buffer (with MgCl2), I μ I dNTP (2.5mmol/L)、I μ I HFQl(IOmmoI/L)、I μ I HFQ2(IOmmoI/L)、0.I μ I TaqDNA Polymerase(5U/μ I)、I μ IDNA 模板，13.9 μ I ddH20。PCR 扩增条件为:预变性 94°C 5min,变性 94°C 35s，退火 50°C 40s,延伸 72°C 40s，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。3、用I %琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。实验结果 检测结果如图1所示，从图1中可以看出本实施方式用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物HFQ1/HFQ2能够准确的扩增出凝结芽孢杆菌的靶标序列片段，而未能从其他属细菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将I号泳道对应的扩增片段进行测序，经Blast比对分析，确定其为凝结芽孢杆菌特异基因序列。表1菌种来源表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQ1序列与SEQ ID NO.1相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG；反向引物HFQ2序列与SEQ ID NO.2相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定凝结芽孢杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物是一对特异性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物 HFQl 序列与 SEQ ID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列与 SEQ ID N0.2 相同，为:GTTTCTGAAATGTATGCACG。2.一种如权利要求1所述的特异性引物鉴定凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans),准备对照菌株； (2)以步骤⑴中的细菌DNA为模板，用HFQ1/HFQ2引物进行PCR扩增；和 (3)用I%琼脂糖凝胶电泳对上述PCR扩增结果进行验证。3.根据权利要求2述的方法，其特征在于:步骤(2)中，正向引物HFQl序列与SEQID N0.1 相同，为:GTCACGGAAGAGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：符雷，郗洪生，施腾鑫，陆亚怡，
申请(专利权)人：江苏恒丰强生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32