一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用。结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：本发明专利技术还涉及上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。本发明专利技术所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中，寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合物，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用，属于肺结核疫苗研制

技术介绍
肺结核是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，具有较高的致死率。结核病主要通过呼吸道传染，也可以通过消化道、皮肤和子宫传染。大部分感染者通常没有任何症状，只有部分机体免疫力较低或细胞介导的变态反应增高的感染者才会发病，如果不及时治疗，大约有一半的感染者会死亡。近几年这一疾病的发病率逐年上升。造成这一现象的原因主要有：(1)抗生素的滥用导致病菌耐药性的不断增强；(2)与艾滋病的交叉感染；(3)不发达国家较差的基础医疗设施和环境(J.Infect.Dis.,1999,179,S461；Drugs,1997,53:40；Pharmacotherapy,1998,18:738)。因此，研制新型、有效、安全的结核病药物成为国内外学者共同关注的一个重要课题。结核病的治疗方法主要是抗生素和免疫治疗。抗生素治疗周期较长，不但给患者的免疫系统造成了非常大的伤害，而且使病菌的耐药性不断增强。免疫治疗是预防结核病的非常有效的措施，不存在细菌耐药性和削弱患者免疫力的问题。目前，预防结核病的主要疫苗是卡介苗(BCG)。但是，研究发现BCG对结核病的免疫保护力低于80％(TrendsMicrobiol.,2008,16:456)，对于有免疫缺陷的病人，BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此，人们迫切需要一种新的疫苗来替代BCG。为了达到这个目的，人们对结核杆菌的细胞结构进行了深入的研究。研究发现，其细胞壁的最外层含有结构非常复杂和特殊的糖聚合物，主要包括分枝酸-阿拉伯半乳糖复合物(mAG)和脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)(Tuberculosis,2003,83:91)。其中，LAM在结核杆菌感染人体细胞的免疫学过程中扮演了非常重要的作用，它能够促进宿主巨噬细胞中有机体的存活，同时在结核杆菌细胞中LAM是高度保守的(FEMSMicrobiol.Rev.,2011,35:1126)。因此，可以根据LAM的结构特征，设计合成LAM寡糖片段，并将其作为半抗原与蛋白质缀合，来制备复合糖缀合物疫苗。目前，相关的研究工作主要集中在LAM寡糖片段的合成方法学上，只有少数人将寡糖片段与蛋白质连接。PeterH.Seeberger等(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:16791)高效的合成了磷脂酰肌醇(PI)和含有1-6个甘露糖苷的磷脂酰肌醇(PIM1-PIM6)，在每一个PIM的还原端都有一个硫醇作为连接基团与血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)连接，但是，这些糖蛋白的免疫活性测试结果并不理想。DavidR.Bundle等(BioconjugateChem.,2014,25:685)将LAM非还原端阿拉伯分支六糖通过点击化学反应连接在一个共聚维酮上，这一聚合物是由乙酸乙烯酯和N-乙烯基-2吡咯烷酮通过共聚合反应得到的，然后脱去聚合物上的乙酰基，再通过引入氨基、叠氮以及炔基等功能基团作为坠与糖或肽连接在一起。结果表明，最终的络合物能够作为较好的非蛋白抗原，很容易在ELISA板上产生吸附作用，在分析抗体与半抗原的连接方面表现出较好的特性。当前，结核杆菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段，有许多问题函待解决。目前，以结核分枝杆菌LAM非还原端含有甘露糖片段的阿拉伯寡糖为半抗原，与载体连接制备结核杆菌复合寡糖缀合物疫苗，尚未见相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用，其中的寡糖是结核杆菌细胞表面夹膜多糖的寡聚衍生物。本专利技术通过如下的技术方案来实现：一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖：式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一个整数，b是0到20中的任意一个整数，m是0到10中的任意一个整数，n是0到20中的任意一个整数，c是0或1，d是0或1，e是0或1；X选自：-CH2-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一；连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分；t是与载体连接的寡糖的数量，t为1～30中的任意一整数；载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉毒素无毒突变体(CRM197)、单磷酰化的脂质A(lipidA)、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。根据本专利技术优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式为如下之一：式中，j1是1到10中的任意一个整数，j2是1到10中的任意一个整数，k是33或35,t是1到30中的任意一个整数。根据本专利技术优选的，所述的载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素无毒突变体(CRM197)之一。根据本专利技术进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：根据本专利技术进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：根据本专利技术进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。有益效果本专利技术所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中，寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合物，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。附图说明图1是化合物A11的1HNMR谱图；图2是A11-KLH寡糖缀合物的特异性抗体滴度图；图中kappa代表针对化合物产生的免疫球蛋白中轻链为Kappa的免疫球蛋白，IgM代表针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白，IgG1是针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为γ的免疫球蛋白的一个亚型。具体实施方式为了更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合实施例作进一步详细描述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：通用的合成方法A：糖基化反应取糖基供体(1.2个当量)、糖基受体(1个当量)和分子筛(与供体重量相等)溶于干燥无水的二氯甲烷中，在氮气气氛下将反应液降温至-30℃，搅拌30分钟，加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS，1.2个当量)和催化量的三氟甲磺酸银(AgOTf)。反应液缓慢升至室温，待TLC检测到原料全部反应后用三乙胺中和，过滤除去不溶的固体，滤液旋干，粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。B：去乙酰化反应将原料溶于甲醇，搅拌条件下加入1mol/L的甲醇钠甲醇溶液调节pH值至10左右，将反应液置于室温下搅拌反应3小时，TLC检测至原料全部反应完毕，反应液用酸性树脂(amberliteIR120)中和，过滤除去酸性树脂，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。C：脱二甲基叔丁基硅(TBS)保护的反应将原料(1个当量)溶于四氢呋喃，在搅拌条件下加入四正丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液(1mmol/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)‑(Ⅱ)中的任意一寡糖：式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一个整数，b是0到20中的任意一个整数，m是0到10中的任意一个整数，n是0到20中的任意一个整数，c是0或1，d是0或1，e是0或1；X选自：‑CH2‑、‑NH‑、‑O‑、‑C(O)‑、‑S‑或之一；连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分；t是与载体连接的寡糖的数量，t为1～30中的任意一整数；载体选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体、单磷酰化的脂质A、1,2‑二硬酯酸‑3‑磷脂酰乙醇胺或1,2‑二油酰‑SN‑甘油‑3‑磷酰乙醇胺之一。

【技术特征摘要】
1.一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：载体选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体、单磷酰化的脂质A、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭忠武，王利振，顾国锋，安莲，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37