一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-15b-hcGSN，利用IPTG诱导表达得到N端带有His标签的重组目的蛋白hcGSN，并经过镍离子亲和层析一步纯化可以得到纯度较高的重组蛋白hcGSN。本发明专利技术还在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点，需要时可以使用凝血酶去除His标签。本发明专利技术提供了一种生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化能够高效、简便、稳定地获得高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白hcGSN。该重组蛋白为相关科学研究提供物质基础，未来可能被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
,涉及一种人胞质凝溶胶蛋白(human cytoplasmicgelsolin，简称hcGSN)的表达纯化方法，包括其工程菌的构建、重组人胞质凝溶胶蛋白的表达和纯化。
技术介绍
凝溶胶蛋白普遍存在于细胞、血液和脑脊液中，是一种多功能的肌动蛋白结合蛋白。凝溶胶蛋白的经典功能是调节肌动蛋白丝聚合、解聚和剪切，从而在细胞骨架结构重排和细胞运动等过程中发挥重要作用。同一个凝溶胶蛋白基因由于外显子的不同剪接方式，产生了两种形式的凝溶胶蛋白，包括胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白。血浆凝溶胶蛋白比胞质凝溶胶蛋白在N端多出25个氨基酸残基，其余氨基酸序列完全相同。大量研究证据表明凝溶胶蛋白与多种疾病的发生和发展密切相关。目前血浆凝溶胶蛋白被应用于治疗感染、急性损伤和胺毒症等。最新的研究发现，胞质凝溶胶蛋白与肿瘤和阿尔茨海默症等疾病相关。与正常组织相比，胞质凝溶胶蛋白在多种癌变组织中的表达呈下降趋势，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肠癌及肺癌等。当癌细胞中过量表达胞质凝溶胶蛋白时，细胞集落的形成显著受到抑制。此外，胞质凝溶胶蛋白可能通过抑制癌细胞的生长来抑制机体内肿瘤的生长和转移等。阿尔茨海默症是一种以学习、记忆和认知障碍为主要特征的神经退行性疾病，其特征包括细胞外老年斑、细胞内神经纤维缠结和神经元丢失等。阿尔茨海默症患者脑中老年斑的主要成分是β_淀粉样肽。目前已有多个研究小组尝试使用凝溶胶蛋白来治疗阿尔茨海默症，并且一致发现胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白都能够清除阿尔茨海默症中的老年斑，降低淀粉样肽的水平。未来胞质凝溶胶蛋白有望被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。因此，在体外过量表达并大量纯化胞质凝溶胶蛋白将为相关研究奠定基础。但是目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。因此，需要对该蛋白的表达纯化方法做进一步的改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，解决目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。本专利技术通过以下技术方案来实现:，该方法包括以下步骤: (I)构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因(hcGSN)的重组表达载体pET-15b-hcGSN，主要是以人血浆凝溶胶蛋白cDNA (GenBank: X04412.1)为模板，通过设计上游引物FW(hcGSN):5' - CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC -3'和下游引物 RV (hcGSN): 5' -CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3'，PCR获取人血浆凝溶胶蛋白基因，构建入表达载体得pET-15b-hcGSN ； (2)将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株； (3)将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37°C诱导表达4小时； (4)5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清； (5)将上清上样于镍离子亲和层析柱NiSepharose 6 Fast Flow,纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。进一步的，在所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。采用上述技术方案的积极效果:本专利技术利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本专利技术实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN。在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser),需要时可以使用凝血酶去除His标签；该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。【附图说明】图1通过菌落PCR方法鉴定转化有重组质粒pET-15b_hcGSN的阳性克隆，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道I为阳性克隆的菌落PCR产物； 图2通过限制性内切酶酶切的方法鉴定重组质粒pET-15b-hcGSN，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道I为重组质粒pET-15b-hcGSN的XhoI酶切产物； 图3通过SDS-PAGE凝胶电泳分析IPTG诱导下大肠杆菌BL21中重组蛋白hcGSN的表达情况，其中M代表蛋白分子量标准；泳道I为未经IPTG诱导的对照组；泳道2为0.4mMIPTG诱导组； 图4通过SDS-PAGE凝胶电泳分析大肠杆菌表达的重组蛋白hcGSN的可溶性，其中，M代表蛋白分子量标准；泳道I为诱导后细菌裂解液上清；泳道2为诱导后细菌裂解液沉淀； 图5通过SDS-PAGE凝胶电泳分析经亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化的hcGSN蛋白，其中，M为蛋白分子量标准；泳道I为上样样品；泳道2-5为从亲和层析柱洗脱的hcGSN蛋白样品； 图6通过Western blot鉴定重组蛋白hcGSN，其中，M为蛋白分子量标准；泳道I为SHSY-5Y细胞的总蛋白；泳道2为纯化的hcGSN蛋白样品。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本专利技术的限制: 实施例1 合成扩增人胞质凝溶胶蛋白hcGSN基因的引物，引物设计如下:上游引物 FW(hcGSN):5/ - CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC-3'； 下游引物 RV(hcGSN):5' -CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3'； 其中上游引物和下游引物中都引入了的限制性内切酶通Ol的单酶切位点。实施例2 本实施例说明pET-15b-hcGSN重组表达载体的构建。以人血浆凝溶胶蛋白cDNA (GenBank: X04412.1)为模板，使用实施例1中的上游引物FW(hcGSN)和下游引物RV(hcGSN)，通过PCR扩增hcGSN基因。具体PCR程序如下:95°C预变性5分钟；95°C变性I分钟，64°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，总循环数是25 ;最后72°C延伸10分钟。用限制性内切酶XhoI分别酶切PCR产物和原核表达载体pET15b。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收得到相应的DNA片段。利用T4 DNA连接酶在16°C进行过夜连接，并将连接产物转化于大肠杆菌DH5a感受态细胞，37°C培养。从转化平板上挑取单克隆，利用菌落PCR的方法来筛选含有pET-15b-hcGSN重组表达载体的阳性克隆。实验结果(见图1)显示，经菌落PCR得到分子量大约为2200 bp的PCR扩增产物(泳道1)，初步鉴定为阳性。从筛选出的阳性克隆中提取质粒，并进行XhoI单酶切鉴定。如图2中泳道I显示，重组质粒经XhoI单酶切得到分子量大约为2200 bp的hcGSN DNA片段。另一个分子量大约为5700bp的DNA片段为p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因（hcGSN）的重组表达载体pET‑15b‑hcGSN；（2）将重组表达载体pET‑15b‑hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株；（3）将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37℃诱导表达4小时；（4）5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清；（5）将上清上样于镍离子亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow，纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。

【技术特征摘要】
1.一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因(hcGSN)的重组表达载体pET-15b-hcGSN； (2)将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株； (3)将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37°C诱导表达4小时； (4)500...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉丽娜，华子春，赵熙，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32