采用动物细胞流加培养方式精确控制单克隆抗体产品质量的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用哺乳动物细胞培养生产单克隆抗体药物的工艺过程控制策略，该工艺采用降低培养温度和缩短培养周期等方式，有效地控制了单抗的翻译后修饰特征，如电荷分布，糖型等。该工艺具有稳定性好，可操作性强、批次间差异小等的特点，极大地拓宽了该工艺的适用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物细胞培养领域。更具体地,本专利技术涉及一种。
技术介绍
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的单克隆抗体、疫苗、和生长因子等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。动物细胞培养培养方式主要有三种，批培养，流加培养和灌注培养。近年来还有诸如借助美国Refine公司的ATF系统进行的混合模式(Hybrid)培养。相对于批培养而言，连续或间歇地向反应器内加入补料培养基，延长培养周期，获得更高的细胞密度和抗体产量。而灌注培养培养周期较长，通常在2-3个月，因此对培养工艺要求较高，适合于稳定性较差蛋白药物的生产。电荷分布和糖基化作为蛋白质翻译后修饰的重要指标，对于蛋白质的折叠、运输和定位起着重要作用 基化过程受很多因素的影响，包括细胞种类、培养基的差异、培养过程的不同控制、高尔基体的转运时间、细胞的状态及细胞内核酸等前体物质的利用等。通过优化条件提高蛋白质的糖基化，保证不同批次间蛋白质糖基化的一致性，将会大大增加重组糖蛋白药物的治疗效果。培养温度作为动物细胞培养的重要控制参数，直接影响到单克隆抗体的产量和质量。通过优化培养温度，可以提高单克隆抗体的产量，同时可以改变抗体的电荷分布，影响酸性组分和碱性组分的比例，进而影响抗体在动物体内的药代动力学行为。培养周期对于细胞培养也至关重要，随着培养周期的延长，细胞密度和活率逐渐下降，代谢毒副产物逐渐累积，对抗体的糖基化产生重要影响。高甘露糖会加快抗体在动物体内的清除，缩短半衰期，并可能产生免疫原性，进而影响抗体的功效。研究表明，随着培养周期的延长，高甘露糖的比例会逐渐增加。因此控制合适的生产周期对于获得高质量的抗体非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种。为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为:本专利技术提供的技术方案包括如下步骤:(I)细胞培养初始温度36-37 °C，培养5_8天，当CHO细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；(2)当细胞生长接近平台期时，降低温度至31-33°c，进行流加培养，降低温度2-7天后结束细胞培养。实验结束后，进行抗体电荷分布和糖型比例检测，控制抗体酸性组分小于25%，高甘露糖比例小于5%。在一个实施方案中，所述方法的细胞接种密度为0.3-0.6*106cellS/ml，PH范围6.7-7.4，溶氧30-50%空气饱和度，搅拌转速50_300rpm。在另一个实施方案中，所述方法溶氧40%空气饱和度，搅拌转速80_250rpm。在另一个实施方案中，所述方法的培养周期为7-15天。本专利技术选择流加培养方式进行单克隆抗体表达，在合适时间降低培养温度，并选择合适培养周期，以达到精确控制抗体的电荷分布和糖基化特征。培养温度是影响抗体生产的一个关键因素。动物细胞生长通常在37°C左右。在此条件下，细胞增殖速度较快。当温度下降后，细胞代谢逐渐变慢，处于维持期，细胞可保持较高的活率，此时以表达 抗体为主。此外，温度也会影响抗体的电荷分布。例如，降低温度会降低抗体的酸性组分。培养周期是影响抗体生产的另一个重要因素。随着培养周期的延长，细胞密度和活率均出现下降，代谢毒副产物逐渐累积，培养环境的恶化会影响抗体的糖基化特征。研究发现，高甘露糖的比例随着培养周期的延长而增加。因此缩短培养周期有利于降低高甘露糖的比例。本方法采用分阶段控制策略。第一阶段，即步骤(I )，细胞培养初始温度控制在36-37°C，培养4_8天，细胞快速生长至平台期，以期获得较高的细胞密度；第二阶段，即步骤(2)，降低温度至31_33°C，一方面降低细胞代谢，维持较高的细胞活率，另一方面促进抗体的合成，同时降低抗体的酸性组分，并有利于蛋白的稳定。本专利技术采用流加培养方式进行单克隆抗体表达，具有工艺稳定稳定性好，可操作性强、批次间差异小等的特点，非常适合于动物细胞培养生产单克隆抗体。【附图说明】图1显示分段培养与对照培养细胞密度比较图。图2显示分段培养与对照培养抗体表达量比较图。图3显示分段培养与对照培养电荷分布比较图。图4显示分段培养与对照培养高甘露糖比例比较图。图5显示分段培养与对照培养细胞密度比较图。图6显示分段培养与对照培养细胞密度比较图。图7显示分段培养与对照培养抗体产量比较图。【具体实施方式】以下结合附图通过【具体实施方式】的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改和改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。实施例1CHO细胞表达单克隆抗体A1.材料:稳定表达单克隆抗体A的CHO细胞株(ATCC)，商业基础培养基和补料培养基(美国 Thermo Fisher 公司，美国 Life Technologies 公司)。2.生物反应器:3L玻璃生物反应器(荷兰Applikon公司)，500L 一次性生物反应器(美国赛默飞世尔公司)3.3L反应器细胞培养分段控制法:稳定表达单克隆抗体A的CHO细胞株，接种密度0.3-0.6*106cellS/ml，起始培养温度36.5±0.5°C，pH控制在6.7-7.4，搅拌转速150rpm，溶氧40%空气饱和度，培养至第5天降低温度至32.5±0.5°C，培养周期10-11天。4.3L反应器细胞培养分段控制法与对照培养法比较:(I)对照培养法:稳定表达单克隆抗体A的CHO细胞株，接种密度0.3-0.6*106cells/ml，起始培养温度 36.5±0.5°C, pH 控制在 6.7-7.4，搅拌转速 150rpm, 溶氧40%空气饱和度，培养过程维持恒定温度。(2)分段培养法与对照培养法细胞密度测定:细胞培养计数常规采用血球计数法检测细胞密度，结果见附图1。(3)分段培养法与对照培养法蛋白表达量测定:培养第9、10、11天，采用ProteinA亲和层析方法测定，结果见附图2。(4)分段培养法与对照培养法电荷分布检测:采用高效液相离子交换色谱法(WCX色谱分析柱)，结果见附图3。(5)分段培养法与对照培养法糖型分析:参考市售2-AB标记检测试剂盒(美国Glyko公司),结果见附图4。(6)结果比较细胞密度的比较:两种细胞培养方法中，从第I天到第5天，细胞均处于旺盛的生长期;第5天细胞生长接近最高密度；此后，细胞生长处于维持期，细胞密度曲线呈现一个平台期，两种方法细胞最高密度无明显差异，分段培养法培养结束时的密度高于对照培养法，见附图1。抗体表达量比较:两种细胞培养方法中，第9、10、11天，分段培养法的蛋白表达量均高于对照培养法约25%，见附图2。电荷分布比较:两种细胞培养方法中，第9、10、11天，分段培养法抗体的酸性组分所占比例明显低于对照培养法，见附图3。糖型分析比较:两种细胞培养方法中，随着培养时间的延长，高甘露糖比例逐渐增加，分段培养法较对照培养法略高，达到7%左右，见附图4。由于分段培养条件下抗体产量较高，并且酸性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用细胞流加培养方式制备单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1）细胞培养初始温度为36‑37℃，培养5‑8天，当CHO细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；2）降低温度至31‑33℃，进行流加培养，降低温度2‑7天后结束细胞培养。

【技术特征摘要】
1.一种采用细胞流加培养方式制备单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤:1)细胞培养初始温度为36-37°C，培养5-8天，当CHO细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；2)降低温度至31-33°C，进行流加培养，降低温度2-7天后结束细胞培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的...

【专利技术属性】
技术研发人员：段须杰，刘睿，徐卫涛，
申请(专利权)人：江苏先声药物研究有限公司，江苏先声药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32