本发明专利技术提供能刺激皮肤细胞修复具持续作用的重组融合蛋白，用以改善公众健康、美容或用于创伤、疾病的治疗。本发明专利技术提供了人血清白蛋白和一种细胞因子多肽利用基因工程方法重组形成的融合蛋白，该融合蛋白，1)可单独或组合使用刺激细胞的修复，特别是可使人体表皮系统中的各种细胞的发育、更新；2)可在体内、体外大大延长这些细胞因子的寿命，以达到含细胞因子产品的最大稳定性和持续作用效果；3)融合形式的细胞因子可以组合使用，能够最大限度地获得使用细胞因子所带来的刺激表皮细胞生长、修复持续作用及增效作用；和4)利用酵母菌发酵生产的发酵液，经简单的加工可直接用于以美容为目的的产品制作。
【技术实现步骤摘要】
重组人血清白蛋白/类胰岛素生长因子融合蛋白
[0001 ] 本专利技术是中国专利技术专利ZL200710057571.9的分案申请，也是中国专利技术专利ZL201110211843.2的继续分案申请，也是中国专利技术专利ZL021428816和ZL2004100428148的继续申请。本专利技术涉及基因重组及表达的人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，并涉及单一融合蛋白或不同融合蛋白组合使用的方法。特别涉及利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白与人细胞生长因子所形成的融合蛋白(HSA/GF)。细胞生长因子包括:表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(TOGF)、角质细胞生长因子(KGF)和类胰岛素生长因子(IGF)等。
技术介绍
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR, “白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon,纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90%的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血 浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP33045UEP361991和中国专利申请CN2004010057313.7中公开。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。综上所述，治疗性蛋白质与白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高剂量使用。人源或重组人血清白蛋白在美容产品中的使用也获得了十分有意义的实际应用，并在专利CN01810411.8中有具体的描述。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药。利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌中表达为融合蛋白，可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性，和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化。该项蛋白药物体内修饰公共技术平台，在于在林、富岩中国授权专利ZL02142881.6和ZL200410042814.8中已公开，在此引为参考文献。
技术实现思路
本【专利技术者】通过动物和细胞的体内体外实验证明了人血清白蛋白与细胞生长因子形成的融合蛋白可刺激细胞增生，并具有比单体的细胞生长因子在体内和体外停留更长的时间(长半衰期和持续性)，细胞和动物实验还发现融合蛋白具有与治疗性蛋白单体相同的摩尔生物活性。当复合使用由HSA和不同生长因子形成的融合蛋白(HSA/GF)的组合时，可具有同时刺激多种皮肤细胞的修复和具协同增效作用，而适用于美容、创伤和疾病的治疗，由此完成了本专利技术。本专利技术所涉及的细胞生长因子(GF)包括但不局限于，表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、角质细胞生长因子(KGF-2)和类胰岛素细胞生长因子(IGF)。下面就其特性分别简述如下:①表皮细胞生长因子(Epidiuen cell Growth Factor, EGF):是EGF是人体分泌的由五十三个氨基酸所组成的具有生物活性的蛋白质，它广泛分布在血液、唾液、尿液等体液中。它具有广泛的生物学活性，能促进表皮细胞的分裂，加速细胞的新陈代谢，使新生的表皮细胞迅速替代老化的细胞(Carpenter，实验细胞研究，164:1_10，1986)。②角质细胞生长因子(KeratinocyteGrowth Factor, KGF, KGF-2):有多种角质细胞生长因子存在在动物体中。以KGF-2(也叫FGF10)是一种由208个氨基酸组成的碱性蛋白，来源于胚胎上皮细胞、新生或成年间质成纤维细胞的KGF。KGF-2具有促进上皮细胞有丝分裂的作用。能通过吸引成纤维细胞和结缔组织向伤口处移行，促进损伤上皮的修复，表现为温和的促细胞再生作用(Rubin JS等，美国国家科学院院报86 =802-806,1989 ；CN00809802.6)。③血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor, PDGF):血小板衍生生长因子是一种具有神经营养活性的生长因子。人roGF是由A链与B链通过二硫键连接的二聚体。I3DGF的A链之间可形成二聚体(PDGFAA)。近期发现，PDGFAA对雄性小鼠生殖系统的发育起着决定性的作用，提示TOGFAA对于生殖系统某些疾病的诊断和治疗可能具有重要意义。PDGF的B链之间也可形成二聚体(PDGFBB)，对于表皮细胞的增值、再生和受损组织的修复具有极强功效，有效 促进多种细胞分裂和新皮肤再生，修复受损组织，促进胶原蛋白的生成(Josephs等，科学，225 (4662) =636-639,1984 ;李培旺等，生命科学研究，9:346-350,2005)。④成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor, FGF):主要有酸性(aFGF)和碱性(bFGF)两种分子。FGF是来源于中胚层和神经外胚层的多功能细胞因子(Zhao等，移植，56，1177-1182，1993 ；Florkiewicz 等，纽约科学年报，638 =109-126,1991)。具较强的有丝分裂作用。对血管内皮细胞、成纤维细胞等都有促分裂作用。研究表明，通过小鼠、大鼠、家兔等不同的动物模型，观察到FGF等活性多肽具有显著诱导细胞修复，加速创面愈合，减少瘢痕形成的功效。bFGF还能特异地促进体黑色素细胞的分裂。动物试验证明aFGF能促进缺血组织的新生，但由于aFGF在血液中的半衰期太短，而没有在临床试验中显示有明显的效果。⑤膜岛素样细胞生长因子(Insulin-like Growth Factors, IGFs):是一类结构上与胰岛素部分同源并具有胰岛素样活性的多肽，既有促细胞分化和增殖活性，又具有胰岛素样作用，对维持正常胰岛素敏感性和血糖稳态调节都有重要作用。国内外许多研究均表明，IGFs与糖尿病慢性并发症的产生密切相关。IGF-1(SomatomedinC)的促进生长发育，物质代谢等方面的作用报道较多。IGF-2 (somatomedin A ；GenBank:MIM147470),IGF-3 (somatomedin B ；GenBank:MIM193190)也有新的研究发现。除以上所简述的细胞生长因子外，还有其它生长因子可以与人血清白蛋白形成融合蛋白，它们可以单独或复合使用，可以和白蛋白单体或白蛋白融合蛋白单独或复合使用，并用以细胞修复以达美容或创伤、疾病治疗的目的。细胞生长因子在保存中不稳定。以EGF为例，在实际使用过程中，EGF在皮肤伤口环境中也是极不稳定，它被伤口中存在的蛋白酶水解失活，半衰期仅本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征为人血清白蛋白和细胞生长因子相连构成的融合蛋白；进一步地其特征在于，该融合蛋白为重组人血清白蛋白/类胰岛素生长因子融合蛋白，其蛋白质氨基酸序列如Seq ID No.6所示。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征为人血清白蛋白和细胞生长因子相连构成的融合蛋白；进一步地其特征在于，该融合蛋白为重组人血清白蛋白/类胰岛素生长因子融合蛋白，其蛋白质氨基酸序列如Seq ID N0.6所示。2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是分泌型的。3.—种编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如Seq ID N0.5所不。4.如权利要求1所述融合蛋白，可通过将含有融合蛋白核苷酸序列的载体转化、转染或转导脊椎...
【专利技术属性】
技术研发人员：于在林，富岩，
申请(专利权)人：天津林达生物科技有限公司，北京美福源生物医药科技有限公司，天津溥瀛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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