一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼脑细胞系及其构建方法，该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为：CCTCCNO:C2013156。本发明专利技术的大黄鱼脑细胞系可连续传代，能够提供大量的大黄鱼脑细胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育种研究等；其性状优良，为上皮状细胞，呈现出扁平不规则的三角形和多边形等。分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿。本发明专利技术的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类细胞培养
，具体涉及。
技术介绍
大黄鱼(Larimichthys crocea),硬骨鱼纲,S卢形目，石首鱼科，黄鱼属。肉质鲜嫩，经济价值较高，市场需求量较大。上世纪70年代以前野生大黄鱼资源较充沛，年平均捕捞量一度达到12万吨的水平。70年代初由于对野生大黄鱼尤其是对其越冬群体的滥捕乱捞，致使野生大黄鱼产量迅速枯竭。80年代以后，随着近海经济开发、环境污染等原因，导致近海的原各大产卵场不再适宜大黄鱼产卵，现野生大黄鱼捕获量极低。1986年大黄鱼人工育苗得以突破，随后得到重视迅猛发展，现阶段市场大黄鱼都是由海水养殖大黄鱼来提供_。然而，现阶段伴随工业化发展，近海养殖环境进一步恶化；大黄鱼病害频发；大黄鱼亲鱼资源枯竭，种质退化等因素极大的限制了大黄鱼养殖的进一步发展，现阶段大黄鱼养殖产量约8.6万吨，不及70年代以前的捕捞量。因此对大黄鱼病害防治、良种选育、遗传背景的研究极为迫切。 建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。目前关于大黄鱼细胞系的建立仅有孙爱在2010年报道建立了大黄鱼成鱼的鱼鳍、吻端、脾脏三种细胞系，而未见其他组织细胞系的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大黄鱼脑细胞系。本专利技术的另一目的在于提供上述大黄鱼脑细胞系的建立方法。本专利技术的技术方案如下:一种大黄鱼脑细胞系，该细胞系于2013年11月保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为:CCTCC N0:C2013156o本专利技术的另一技术方案如下:一种上述大黄鱼脑细胞系的建立方法，包括如下步骤:(I)大黄鱼脑组织的获取:将7个月大，长9-1 Icm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水(青霉素及链霉素双抗购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL链霉素,配制海水时每IOOmL海水加入ImL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液)中暂养1-1.5小时，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液(IOOmL D-hanks液加入ImL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液)中；(2)原代培养:将上述大黄鱼脑组织切碎至0.7-2.0mm3的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液漂洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27°C恒温干贴24小时，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27°C恒温培养启动原代培养,每周更换完全培养液一次；(3)传代培养:原代培养至贴壁细胞增殖至至少50-60%覆盖率时，移除旧培养液，并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-8天传代一次，所述大黄鱼脑细胞系建立成功。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述完全培养液中包括:DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述完全培养液为:以DMEM/F12培养液为基础，包括终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5%ο β -巯基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纤维素钠、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、lμg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100 μ g/mL链霉素。本专利技术的有益效果是:1、本专利技术的大黄鱼脑细胞系可连续传代，迄今已传代40代，能够提供大量的大黄鱼脑细胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育种研究等。2、本专利技术的大黄鱼脑细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好；3、本专利技术的大 黄鱼脑细胞系的细胞性状优良。为上皮状细胞，呈现出扁平不规则的三角形和多边形等。分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿；4、本专利技术的构建方法所使用的完全培养液中包括DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素，DMEM/F12培养液和胎牛血清FBS为细胞生长提供了充足的营养；β -巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF和人HGF的加入可以刺激细胞活性、加速细胞分裂增殖，同时为细胞体外培养提供了良好的缓冲环境，能够使细胞在长期培养时维持稳定的PH ;青霉素和链霉素加大了抗菌谱，特别在原代培养时，能有效地抑制细菌生长，防止细胞污染。【附图说明】图1为本专利技术的大黄鱼脑细胞系原代培养第3天的显微镜照片(50X);图2为本专利技术的大黄鱼脑细胞系原代培养第10天的显微镜照片(50X);图3为本专利技术的大黄鱼脑细胞系原代培养第15天的显微镜照片(50X);图4为本专利技术的大黄鱼脑细胞系传代培养第2代的显微镜照片(50 X )；图5为本专利技术的大黄鱼脑细胞系传代培养第3代的显微镜照片(50X);图6为本专利技术的大黄鱼脑细胞系传代培养第15代的显微镜照片(50X )；图7为本专利技术的大黄鱼脑细胞系传代培养第28代的显微镜照片(50X);图8为本专利技术的大黄鱼脑细胞系在不同传代比例下的增殖曲线；图9为本专利技术的大黄鱼脑细胞系冻存后复苏24h后的显微镜照片(50 X )；图10为本专利技术的大黄鱼脑细胞系冻存后复苏72h后的显微镜照片(50X);图11为本专利技术的大黄鱼脑细胞系冻存复苏后再传代的显微镜照片(50X)图12为本专利技术的大黄鱼脑细胞系的染色体图(100X);图13为本专利技术的大黄鱼脑细胞系的染色体数目分布图；图14为本专利技术的大黄鱼脑细胞系饥饿处理30天后的显微镜照片(50X);图15为本专利技术的大黄鱼脑细胞系饥饿处理后更换完全培养液36h的显微镜照片(50X)；图16为本专利技术的大黄鱼脑细胞系转染pEGFP-Nl质粒36h的显微照片(100 X )图17为本专利技术的大黄鱼脑细胞系转染0ct4-pEGFP_Nl重组载体36h的显微镜照片(100X)。【具体实施方式】以下通过【具体实施方式】结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。溶液配制D-Hanks 溶液:取 0.4g KCl,0.06g KH2PO4,8.0g NaCl，0.35g NaHCO3,0.132gNaH2PO4.12H20 定容至 1L，于 121。。20min 高压灭菌，4°C保存。另取 D-Glucose 配成 200g/L贮存液，121°C 20min高压灭菌，冷却后-20°C长期贮存。使用时每L D-Hanks溶液加入5mL D-Glucose贮存液以及IOmLlOOX双抗溶液(购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL链霉素)。含双抗的灭菌海水:取新鲜海水，于121°C 20min高压灭菌，使用时每IL灭菌海水加入IOmLl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大黄鱼脑细胞系，其特征在于：该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为：CCTCC NO:C2013156。

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼脑细胞系，其特征在于:该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为=CCTCC N0:C2013156o2.—种权利要求1所述的大黄鱼脑细胞系的建立方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)大黄鱼脑组织的获取:将7个月大,长9-1Icm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水中暂养1-1.5小时，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液中； (2)原代培养:将上述大黄鱼脑组织切碎至0.7-2.0mm3的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27°C恒温干贴24小时，再加入完全培养液翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27°C恒温培养启动原代培养,每周更换完...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艺磊，庄道华，张子平，李敏，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35