变异链球菌rnc基因突变株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株长链状、低致龋能力的变异链球菌（Streptococcusmutans）rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该突变菌株通过变异链球菌UA159构建、筛选和鉴定而获得，保藏编号为：CCTCCM2013211,分类命名为StreptococcusmutansHT120211。本发明专利技术变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。

【技术实现步骤摘要】
变异链球菌rnc基因突变株及其应用
本专利技术涉及一株通过变异链球菌UA159构建、筛选和鉴定而获得的长链状、低致龋能力的变异链球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生，属于龋病预防

技术介绍
龋病发病率高，是最常见的人类感染性疾病之一，WHO调查发现全球约有50亿人患有龋病。在我国，2005年全国第三次口腔流行病学调查显示，5岁儿童的患龋率约为66％，中年人群为88.1％，65岁以上老年人群则高达98％，但龋病的治疗率则不足10％。5岁组乳牙龋齿个数3.5颗(dmft),35-44岁组恒牙龋齿个数4.51颗(DMFT),65-74岁组恒牙龋齿个数14.65颗(DMFT)。变异链球菌是与龋病发生发展关系密切的主要致龋菌。它通过代谢口腔内的碳水化合物产酸、导致牙菌斑生物膜的pH值下降来抑制其他共生菌的生长，从而奠定自己在生物膜中的优势地位。变异链球菌通过生物膜的形成，依靠细胞外基质的保护和其他信号传导通路来应对环境变化带来的压力。其分泌的葡糖基转移酶和果糖基转移酶可以有效合成细胞外多糖，一方面促进细菌与牙齿表面的黏附，一方面为其他的细菌的定植提供结合位点，促进稳定生物膜的形成。变异链球菌的主要致龋毒力因子主要包括其产酸、耐酸、胞外多糖合成、生物膜形成能力等。rnc基因是近年来在其他细菌中被广泛研究的基因。其在大肠杆菌中编码双链RNA特异性的内切核糖核酸酶RNaseIII，参与编码转录调节子gadX-gadW的mRNA处理过程，从而控制大肠杆菌对酸的反应。RNaseIII还被认为影响一些噬菌体、质粒和细胞基因的表达，在RNA处理、转录后基因表达控制、防御病毒入侵方面起着非常重要的作用。在天蓝色链霉菌中，RNaseIII被认为与孢子的形成和抗生素的产生有关。尽管RNaseIII在一些细菌内的生理功能被大量研究，但是在变异链球菌中存在的编码RNaseIII酶的rnc基因的功能并未被研究。其是否参与变异链球菌的一些生物学特性的调控，是否与变异链球菌致龋性有关尚不清楚。迄今为止尚未见到有关变异链球菌rnc基因突变菌株的构建及其在防治龋病中的应用的报道。
技术实现思路
针对上述龋病高发，且没有特效药物防治的现状，本专利技术的目的是提供一株长链状、低致龋能力的变异链球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突变株及其在预防龋病方面的应用。该变异链球菌rnc基因突变株可制成微生态制剂，作为变异链球菌的替代菌株，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。本专利技术的技术思路是：首先，基于龋病的防治尚无特效的药物，且由于变异链球菌是口腔最常见的致龋菌，因此选择致龋菌的变异链球菌作为内源性生态防龋的突破口，实施基因突变技术对目的基因进行敲除，可稳定地产生一株呈长链状、低致龋能力的变异链球菌基因突变株；然后，采用PCR技术以及DNA测序的方法，该株鉴定为变异链球菌rnc基因敲除突变株；最后，对含该株细菌的培养液进行人类龋病动物模型的致龋试验，结果显示出该突变菌株具有能够减少SPF级Vistar大鼠龋病的发生率的效果。具体讲，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术获得具有呈长链状、低致龋能力的变异链球菌rnc基因突变株的方法是(见图1)：采用从位于中国四川省成都市的口腔疾病研究国家重点实验室处获取的变异链球菌UA159(以下简称为“S.mutansUA159”)作为父本株(注：是采用单株进行基因突变)，用BHI培养基培养后，采用PCR连接诱变技术进行突变株的构建，得到一株抗红霉素、呈长链状、低致龋能力，能改善大鼠口腔的菌群结构，减少大鼠龋病的发生率的变异链球菌的rnc基因突变菌株，然后进行产酸、耐酸、耐氧化、早期粘附、生物膜形成及胞外多糖形成能力以及细菌毒力相关因子的比较试验。通过PCR扩增出突变菌株的DNA片段，经测序，获得目的基因序列，证实rnc基因被成功的敲除，确定该分离的菌株突变成功，该菌株为变异链球菌rnc基因缺失突变株(StreptococcusmutansHT120211)，它拥有更长的链状结构，产生更少的致龋毒力因子,已于2013年5月16日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为2013年5月16日，保藏编号为：CCTCCNO:M2013211。本专利技术变异链球菌rnc基因突变株StreptococcusmutansHT120211(以下文章中简称为“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”，图片中简称“HT100211”)按照常规甘油冷冻方法保藏。本专利技术也提供“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”在人类龋病大鼠模型中和父本株变异链球菌UA159的致龋能力的差异比较。分别使用过夜培养的S.mutansUA159和StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211菌液，感染SPF级Wistar大鼠细菌接种成功后，大鼠继续喂养3周，处死，取下颌骨，包埋、对下颌磨牙进行切片观察，照改良的Keyes法对龋坏数目及龋坏程度进行分级，并记录分析。结果表明StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211具有与S.mutansUA159完全不同的致龋能力，突显出本专利技术StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211具有减少人类龋病大鼠模型窝沟釉质龋损和牙本质浅层龋损的发生率的作用和效果。本专利技术具有以下效果：(1)本专利技术对变异链球菌UA159在正常条件下采用PCR连接诱变技术，通过基因重组，使红霉素抗性基因定点替换目的基因rnc,然后经过抗性培养基筛选，PCR+琼脂糖电泳、RT-PCR以及DNA核苷酸测序进行验证，从而可重复、稳定性得到本专利技术的变异链球菌rnc基因突变株“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”。(2)本专利技术“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”，具有抗红霉素、呈长链状、致龋能力低，能改善大鼠口腔的菌群结构，减少大鼠龋病的发生。(3)本专利技术“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”可制成微生态制剂(以作为本专利技术变异链球菌的替代菌株)，调整口腔菌群失调，减少高致龋能力的变异链球菌数量，预防龋病的发生。附图说明本专利技术的变异链球菌rnc基因突变株(StreptococcusmutansHT120211)，已于2013年5月16日由位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCCNO:M2013211。图1为本专利技术的技术流程图图2—4为本专利技术“StreptococcusmutansHT120211CCTCCM2013211”细菌形态鉴定结果图图5为本专利技术“StreptococcusmutansHT120211CCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株变异链球菌（Streptococcusmutans）rnc基因突变株，其特征在于该菌株呈长链状、低致龋能力，能改善大鼠口腔的菌群结构，减少大鼠龋病的发生；该菌株已于2013年5月16日由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO: M 2013211。

【技术特征摘要】
1.一株变异链球菌（Streptococcusmutans）rnc基因突变株，该菌株呈长链状、低致龋能力，能改善大鼠口腔的菌群结构，减...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡涛，杨英明，李克增，张茹，刘思茗，毛梦莹，雷蕾，阳燕，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51