HIF2A基因突变体及其检测与应用制造技术

本发明专利技术涉及医学分子生物学领域，旨在提供一种HIF2A基因突变体及其检测与应用。该分离的编码HIF2A突变体核酸的基因序列如SEQ ID NO：1所示。分离的HIF2A突变体多肽是由前述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术研究发现人HIF2A基因的SEQ ID NO：1所示序列中第2155位核苷酸G→A突变，导致SEQ ID NO：2所示序列中的第549位谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，使蛋白质的半衰期延长，下游基因的表达增高。基于此，本发明专利技术提供了HIF2A基因突变的检测方法。通过对该方法的应用，能够快速了解生物样品是否存在HIF2A基因突变。

【技术实现步骤摘要】
HIF2A基因突变体及其检测与应用
本专利技术涉及医学分子生物学领域，具体地，涉及分离的HIF2A突变体的核酸，分离的多肽，以及筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法和用于筛选易感肝癌和其他肝脏相关疾病的生物样品的试剂盒。
技术介绍
肝癌的发生是环境和基因共同作用的结果，它是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，有资料表明，全球每年有超过50万新患者。全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国，仅我国每年就有约11万人死于肝癌。而肝癌起病隐匿，超过60%的肝癌患者在初次就诊时就已进入中晚期，失去根治治疗的机会，5 年总体生存率只有 7% 左右[Lin H, Yan J, Wang Z, et al.Loss of Immunity-supportedsenescence enhances susceptibility to hepatocellular carcinogenesis andprogression in TLR2_deficient mouse.Hepatology, 2013, 57 (I): 171-82.]。手术切除仍是治疗原发性肝癌的首选，但是众所周知，根治性切除后患者的5年复发率高、转移率高[于秀石，关媛媛，田菊霞.肝癌发生的相关分子机制研究.健康研究(基础理论研究)，2010，30(5):391-393.]。因此寻找实用有效的肝癌易感性筛查、早期诊断、治疗、预后判断的指标早已十分迫切。随着肿瘤分子生物学理论和技术的飞速发展，对各种肝癌相关基因的认识不断深入，且原癌基因、抑癌基因、毒物代谢酶基因、DNA修复基因等的基因突变与肝癌易感性关系的研究也不断深入[郑霄雁，史习舜，胡志坚.肝癌相关基因突变与肝癌易感性的研究.中国肿瘤，2008，17 (5) =390-395.]，但是目前发现的肝癌相关基因的数量有限，且到目前为止，并没有十分理想的肝癌筛查、诊断、治疗、预后判断等的基因。因此，寻找可能的肝癌诱发基因，从而找出可靠的肝癌易感性筛查、早期诊断的指标以及肝癌预后判断的新依据，仍然是当今肝癌研究的热点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种HIF2A基因突变体及其检测与应用。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是:提供一种分离的编码HIF2A突变体核酸，该突变体核酸的基因序列如SEQ ID NO:1所示。本专利技术进一步提供了一种分离的HIF2A突变体多肽，该突变体多肽是由权利要求1所述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本专利技术进一步提供了一种检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的方法，包括以下步骤:(I)确定在生物样品中是否具备HIF2A基因编码的SEQ ID NO:2所示的第549位氨基酸，或者SEQ ID NO:1所示的第2155位核苷酸；该步骤具体包括:利用HIF2A基因的第12外显子特异性的引物，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；所述的生物样品是指分离自人体的血液、各种器官的组织、皮肤、毛发或口腔黏膜，能够用于分离获得权利要求1中所述突变体核酸，或者是通过反转录反应获得CDNA样本以构成所述核酸样本；所述HIF2A基因的第12外显子特异性的引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；(2)检测在所述核苷酸位置是否存在G — A突变，以及所述氨基酸序列是否存在E — K突变；该步骤具体包括:通过比对测序核苷酸图谱,第2155位核苷酸由G变为A，⑶S编码序列上看是第1645位核苷酸发生突变，即发生c.G1645A突变，密码子GAG变为AAG，翻译后氨基酸序列第549个谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，即发生p.E549K突变。本专利技术进一步提供了所述编码HIF2A突变体核酸在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。本专利技术进一步提供了所述编码HIF2A突变体多肽在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于:本专利技术研究发现人HIF2A基因的SEQ ID NO:1所示序列中第2155位核苷酸G — A突变，导致SEQ ID NO:2所示序列中的第549位谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，使蛋白质的半衰期延长，下游基因的表达增高。基于此，本专利技术提供了 HIF2A基因突变的检测方法。通过对该方法的应用，能够快速了解生物样品是否存在HIF2A基因突变。作为对本专利技术的衍伸应用，可以作为发现肝癌及肝脏相关疾病的潜在易感性患者的新的判断依据。【附图说明】图1为含突变位点的患者的正向引物测序图，突变型(G/A)；图2为对照组不含突变位点的正常健康人的正向引物测序图，野生型(G/G)；图3为含突变位点的患者的反向引物测序图，突变型(C/T)；图4为对照组不含突变位点的正常健康人的反向引物测序图，野生型(C/C)；图5为根据本专利技术实施例对多个物种HIF2A蛋白质的序列进行比对的结果，其中531位为脯氨酸羟基化位点。图6为病人的红细胞、血细胞比容和血红蛋白变化趋势，其入院前的血常规中，红细胞、血细胞比容和血红蛋白都高于正常，手术后其红细胞、血细胞比容和血红蛋白又开始呈现逐渐增高的趋势。【具体实施方式】以下概括描述本专利技术要求保护的技术方案:1.本专利技术提供了从各型肝病中分离HIF2A新突变致病基因，具有突变的序列(如SEQ ID NO:1所示)，第2155位碱基发生G — A的突变。本专利技术通过Sanger测序的方法确定了肝癌及其他肝脏相关疾病的新的致病基因突变(HIF2Ac.G1645A, p.E549K)。HIF2A基因突变体根据本专利技术的实施例，该核酸具有突变的序列(如SEQ ID NO:1所示)。在本文中所使用的表达方式“编码HIF2A突变体的核酸”，是指与编码HIF2A突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与HIF2A突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本专利技术的一个具体示例，前面所述的编码HIF2A突变体的核酸为DNA。根据本专利技术的实施例，专利技术人确定了 HIF2A基因的新突变体，这些新突变体与肝癌及其他肝脏相关疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易感肝癌及其他肝脏相关疾病的目的。该编码HIF2A突变体的核酸，是本申请的专利技术人通过Sanger法测序方法确定的肝癌及其他肝脏相关疾病的致病基因上的新突变。本次发现的突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。突变型HIF2A基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，其编码的HIF2A蛋白(编码区)，该蛋白质含有870个氨基酸，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。专利技术人发现的新突变体如SEQ ID NO:2所示，具有ρ.Ε549Κ突变，即本专利技术的HIF2A基因突变体的cDNA中第2155位的G突变为A，由此，其所编码的产物HIF2A蛋白(如SEQID NO:2所示)，具有p.E549K突变，即549位的E (谷氨酸)突变为K(赖氨酸)。本专利技术还提供了从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的编码HIF2A突变体核酸，其特征在于，该突变体核酸的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的编码HIF2A突变体核酸，其特征在于，该突变体核酸的基因序列如SEQ IDNO:1所示。2.一种分离的HIF2A突变体多肽，其特征在于，该突变体多肽是由权利要求1所述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。3.—种检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)确定在生物样品中是否具备HIF2A基因编码的SEQID NO:2所示的第549位氨基酸，或者SEQ ID NO:1所示的第2155位核苷酸； 该步骤具体包括:利用HIF2A基因的第12外显子特异性的引物，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序； 所述的生物样品是指分离自人体的血液、各种器官的组织、皮肤、毛发或口腔黏膜，能够用于分离获得权利要求1中所述突变体核酸，或者...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兰娟，曹红翠，苏晓茹，俞炯，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33