抗体纯化方法技术

本发明专利技术涉及制备高纯度、高质量的抗体群的方法，所述方法相继采用阳离子交换柱、疏水相互作用柱和阴离子交换柱来去除抗体同种型和杂质，而不采用蛋白A柱；以及通过以上方法制备的抗体群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备高纯度、高质量抗体群的方法，该方法通过连续采用阳离子交换柱、疏水相互作用柱以及阴离子交换柱，而不使用蛋白A柱，从而除去抗体同种型和杂质；本专利技术还涉及通过上述方法制备的抗体群。
技术介绍
蛋白A柱常在许多用于生产抗体药的纯化工艺中用到。利用蛋白A柱的优势在于在工艺初期就能获得高纯度产品。然而，蛋白A的成本比其他常用的离子交换树脂贵30倍，从而导致了抗体药生产的高成本。根据之前的报道，蛋白A树脂在抗体药生产相关原料成本中占了 35%(Journal of Chromatography A, 1024 (2004) 79-85)，抗体样品中残留的微量蛋白 A 会在施用于人体时导致免疫或其他生理反应(单克隆抗体的纯化工具，经验证的生物系统，图森，AZ,1996 (Purification Tools for Monoclonal Antibodies, ValidatedBiosystems, Tucson, AZ, 1996))。因此，需要对采用蛋白A柱的纯化工艺进行持续监测，并需要在每个纯化步骤中去除残余的蛋白A。此外，由于蛋白A基于其与靶标的生物亲和性而起作用，其缺点在于化学稳定性较差。因此，为了维持蛋白A的活性，不得使用IM的NaOH，即使其对于柱子的清洗和后续的使用而言非常关键。而不使用IM的NaOH，就很难完全去除柱子上的杂质，因此柱子在后续使用中的再利用次数就会显著低于化学树脂允许使用次数。尽管成本高昂，全球各大医药公司仍然倾向采用蛋白A来纯化抗体，因为其能在早期就获得高纯度的抗体。例如，Gentech生产的抗体药，即赫赛汀(Herceptin),其纯化工艺采用了蛋白A、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、疏水相互作用树脂(HIC) (SvenSommerfeld a, Jochen Strube b,化学工程和工艺 44(2005) 1123-1137) (Sven Sommerfelda, Jochen Strube b, Chemical Engineering and Processing44 (2005) 1123-1137))。然而，鉴于蛋白A具有上述的缺点，仍需要开发更有效、更经济的。为了开发一种在不使用蛋白A柱的情况下就能纯化抗体的方法，任何候选方法首要的是可以去除与蛋白A—样多或更多的杂质。尤其是当CHO细胞系用作宿主细胞产生抗体时，细胞培养液不仅含有所需的抗体，还含有大量的杂质，包括宿主细胞蛋白(HCP)，宿主细胞来源的DNA(HCD)，以及生长因子。因此，在任何不用蛋白A纯化抗体的情况下，由于存在大量杂质，早期成功去除杂质都是非常重要的要素。为了解决这个问题，Warren Schwartza等开发了利用MEO HyperCel的，这是一种疏水性电荷诱导层析法(HCIC) (Journal of ChromatographyA，908 (2001) 251-263)。在该方法中，无需超滤，就可自含盐的细胞培养物中分离到高纯度的抗体。然而，HCIC仍然比使用离子交换树脂贵2-5倍。且也尚未发现通过HCIC是否就能比用离子交换树脂更有效地去除杂质。同时，Egisto Boschetti建议采用亲硫性层析法(thiophilic chromatography, T_gel),其基于树脂的化学亲和力而生产高纯度的抗体，而蛋白A层析法则基于其本身的生物亲和力(J.Biochem.Biophys.Methods49 (2001) 361-389)。然而，就制备高纯度抗体而言，T-gel并不如蛋白A的那样有效，且其成本比采用离子交换树脂的抗体制备方法仍要贵5倍。因此，其还未用于工业化生产。同时，另一种纯化方法，离子交换树脂例如阳离子交换树脂可在吸附柱内使用。最近在产业中利用的阳离子交换树脂的例子包括:GE-医疗生产的快流速CM和快流速SP，默克(Merck)生产的 Fractogel SO3 和 Fractogel COCT(US2007029244)。然而，阳离子交换树脂的限制仍然在于在早期杂质去除不够。同样地，对纯化工艺的诸多条件进行优化是成功开发新纯化工艺的关键。在抗体纯化工艺中，维持质量的恒定与去除杂质一样重要。抗体由二硫键连接的两条重链和两条轻链组成，而重链的Fe片段则被糖基化。然而，CHO细胞作为宿主细胞而产生的抗体含有多个同种型(Hongcheng Liu, Georgeen Gaza-Bulseco, Journal ofChromatography B, 837 (2006) 35-43)。大多数同种型有少许氨基酸修饰，例如脱酰氨化、氧化等等(Isamu Terashima, Akiko Koga,分析生物化学368 (2007) 49-60)。特别是，当作为抗原结合位点的互补决定区(CDR)通过脱酰氨基化修饰后形成抗体同种型，则抗原和抗体的结合亲和力下降，从而影响了抗体的生物活性(Reed J.Harrisa, Bruce Kabakoff, Journalof Chromatography B, 752 (2001) 233-245)。所形成的抗体的同种型有很多种，例如，天冬酰胺经脱酰氨化生成天冬氨酸(BoxuYan, Sean Steen, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.98, N0.10, 0ctober2009),甲硫氨酸经氧化生产甲硫氨酸硫酸盐(methionine sulfate) (Chris Chumsae, GeorgeenGaza-Bulseco, Journal of Chromatography B, 850(2007)285-294)? 此外，重链 N-末端的谷氨酸可通过形成五元环结构而转化为焦谷氨酸盐(William E.Werner, SylviaWu, Analytical Biochemistry342 (2005) 120-125)。由于这些同种型影响抗体的生物活性，在抗体生产过程中需要控制抗体中同种型的比例。为了调整抗体同种型的量，可采用阳离子交换层析法，因为其能够基于净电荷的不同，将吸附在柱子上的所需抗体通过解离而进行分离，但是，适当的纯化条件也需要具体确定。
技术实现思路
技术问题为了尝试开发不使用昂贵的蛋白A柱而获得高质量和高纯度抗体群的制备方法，本专利技术人完成了本专利技术，其中，为了去除沉淀物，通过降低PH对不含细胞的细胞培养物上清液进行预处理。然后将预处理的样品相继通过阳离子交换柱、疏水相互作用柱、以及阴离子交换柱，从而有效去除杂质(例如宿主细胞蛋白(HCP))，并最终制备成具有所需比例的活性抗体和抗体同种型的高质量抗体群。问题的解决方案本专利技术的目的是 提供制备抗体群的方法，其中，群内65%以上为活性抗体，其包括:(a)将含有抗体混合物的样品上样至预平衡的阳离子交换柱，然后任选用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型；(b)将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备抗体群的方法，其中所述群内65％以上为活性抗体，所述方法包括：(a)将含有抗体混合物的样品上样至经预平衡的阳离子交换柱，然后任选采用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型；(b)将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP)；和(c)将步骤(b)的洗脱物上样至阴离子交换柱并收集流出物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.15 KR 10-2011-01356521.一种制备抗体群的方法，其中所述群内65%以上为活性抗体，所述方法包括: (a)将含有抗体混合物的样品上样至经预平衡的阳离子交换柱，然后任选采用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型； (b)将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP);和 (C)将步骤(b)的洗脱物上样至阴离子交换柱并收集流出物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的样品制备如下:将培养物上清液的PH调节至4-6的范围内以去除杂质。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中样品的电导率为5-7mS/cm。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体的等电点为8-10。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体为曲妥单抗。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的洗脱物含有65-80%的活性抗体，15-30%的酸性抗体同种型，和5-20%的碱性抗体同种型。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)的所述抗体同种型为酸性抗体同种型。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)的所述阳离子交换柱为羧甲基(CM)琼脂糖柱。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)包括: (i)将样品上样至用含有20-30mM醋酸钠(ρΗ4.5_5.5)以及35_45mM氯化钠(NaCl)的平衡缓冲溶液作预平衡的羧甲基(CM)琼脂糖柱； (ii)采用含有20-30mM醋酸钠(pH4.5-5.5)和35_45mM氯化钠的缓冲液洗柱； (iii)采用含有20-30mM Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)的缓冲液洗柱； (iv)采用含有20-30mMTris-盐酸(pH7.0-7.5)和20_30mM氯化钠的缓冲液洗柱； (V)采用含有20-30mM Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)的缓冲液洗柱；和 (vi)采用含有20-30mM Tris-盐酸(pH7.0-7.5)和80-100mM氯化钠的洗脱缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹志容，李东垠，金元谦，尹正源，白晶殷，
申请(专利权)人：韩华石油化学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR