本发明专利技术涉及一种可过量表达膜蛋白细菌及其应用，该菌株为埃希氏大肠杆菌，命名为Escherichia coli1098-3，保藏号为CGMCC No.8696，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术对膜蛋白异常有极大耐受性，采用上述菌株，可过量表达膜蛋白，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种可过量表达膜蛋白细菌及其应用
本专利技术属于生物表面活性剂领域，特别涉及一种可过量表达膜蛋白细菌及其应用。
技术介绍
本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。正常生理条件下膜蛋白的天然表达水平较低，对其异源大量表达成为功能和结构研究的先决条件。结合膜蛋白纯化和结晶的困难，膜蛋白的异源表达也因其疏水特性、细胞脱容量的有限性、对宿主细胞的毒性等问题成为膜蛋白相关研究的瓶颈。尤其对于真核细胞膜蛋白的原核表达，宿主的不相容性往往会带来更大的难题：截至2005年止，尚无一例以重组表达方式获得结构信息的膜蛋白的报道。而一个耐受膜蛋白的表达菌对于成功表达膜至关重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可过量表达膜蛋白细菌，该菌株对膜蛋白异常有极大耐受性，采用上述菌株，可过量表达膜蛋白，具有良好的应用前景。本专利技术的一种可过量表达膜蛋白细菌，该菌株为埃希氏大肠杆菌，命名为Escherichiacoli1098-3，保藏号为CGMCCNo.8696，其16SrRNA序列如SEQIDNO：1所示。于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的一种可过量表达膜蛋白细菌的应用，具体方法如下：利用超表达载体携带外源膜蛋白基因序列，通过电击转化或热激转化转入菌株，菌株37℃培养OD600至0.3-0.4，加IPTG至终浓度0.7mg/L，培养6-18h，收获菌种。所述电击转化的工艺条件为：0.2cm的电转化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200欧；电击后取出加入1mlSOB液体培养基，37℃培养1小时；涂布于SD平板。所述热激转化的工艺条件为：100L感受态细胞置于冰上，将细胞均匀悬浮；加入10L连接好的质粒，DNA浓度为10pg/L，混匀；冰上放置30分钟；42℃水浴热激55秒；冰上放置10分钟；加100LLB培养液，37℃250转/分振荡培养30分钟；与此同时将LB平板置于37℃，放置片刻后加入4uLIPTG和40uLX-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附渗透；将细菌涂布在含抗生素琼脂平板上，平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。本专利技术描述一种从油污污染土壤中分离得到的细菌，膜厚度大，可耐受较大机械压力，同时也能够耐受膜蛋白毒性，可以对膜蛋白外源表达有较好耐性。根据BLAST聚类分析及形态学鉴定结果（见图1），将该菌株定命名为Escherichiacoli1098-3。该菌经检测可显著降低表面张力，国内外已经发现菌株是前所未见或未有应用的。本专利技术提供的菌株Escherichiacoli1098-3的特征如下：本专利技术该菌菌落圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧条件下生长良好，革兰氏染色呈阳性，形态观察菌体杆状。测定菌株的16SrRNA部分序列，进行系统发育学分析。有益效果本专利技术对膜蛋白异常有极大耐受性，采用上述菌株，可过量表达膜蛋白，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术菌株16SrRNA序列系统发育树；图2左图为普通菌种过量表达膜蛋白细胞结构，右图为本专利技术菌株过量表达膜蛋白细胞结构。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1菌种来源：本菌种来源于油污污染土壤，具体分离方法如下：(1)富集：取油污地土壤1g于富集培养基（牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g,pH7.0～7.6）中，于28℃、120转/min恒温培养48h。再取其培养液2mL转入另一富集培养基中，28℃，120转/min进一步富集培养48h。(2)初筛：取终富集液100μL油平板培养基（原油5g、氯化铵6g、硫酸镁0.2g、氯化钙0.001g磷酸二氢钾4.1g、磷酸氢二钠14g、EDTA0.001g、琼脂20g、酵母粉0.5g、H2O1000ml、pH7.4），初步筛选出透明圈较大的单菌落。(3)复筛：将初筛得到的菌种分别点接于磷酸消解蛋白培养基平板和羽毛粉平板培养基平板，于37℃下恒温振荡培养48h，培养液离心得上清测表面张力大小，最后获得菌株1098-3，表面张力为34.3mN/m。菌种鉴定：(1)菌落形态观察：在LB平板上对菌株进行划线分离，24h后观察单菌落形态并对细菌进行革兰氏染色，观察细胞形态。(2)菌体形态观察：将菌株制片，进行革兰式染色后，用带拍摄装置的光学显微镜观察菌体的形状、大小、及其特殊构造，并拍摄菌体染色照片。(3)分子鉴定①菌株DNA的提取方法A、取1ml细菌过夜培养液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000rpm离心10分钟，去上清液；B、立即加入600μL预热的提取缓冲液，混匀后，65℃温浴1h；C、冰浴冷却(5分钟)，加入600μL酚/氯仿(1:1)溶液，颠倒混匀后，静置10min，然后12000rpm离心6min；D、上清转移至另一个Eppendorf管中，加入等体积氯仿，静置5min，12000rpm离心5min；E、取上清液，加入等体积异丙醇，沉淀DNA；F、用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500μLTE或重蒸水中，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀；②16SrRNA的基因扩增A、PCR反应引物为通用引物：BSF8(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和BSR1541(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)B、在冰上建立PCR反应体系：最后将系统稳定在4℃。取3μL的PCR产物，在1%的琼脂糖凝胶100V下电泳30min，电极缓冲液为0.5×TAE，然后用溴化乙锭(EB)染色检验扩增产物。扩增产物由上海生工生物工程有限公司完成。(4)所得序列的分析测序结果用DNAstar软件对原序列进行编辑，序列在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中进行BLAST分析寻找亲缘关系最近的细菌或克隆，并用ClustalX软件对序列相似性分析。用MEGA4软件，采用Neighbor-Joining方法1000次bootstrap重复验证，采用p-distance模型建立生物系统进化树。PtsG大量表达：利用1098-3菌株表达膜蛋白PtsG，pMALE（AmpR）为常用的蛋白表达载体，将ptsG基因通过酶切连接技术导入该载体内。取混合100ul1098-3过夜培养菌液和5ulPMALE-ptsG混匀，转入0.2cm的电转化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200欧。电击后马上取出加入1mlSOB液体培养基，37℃培养1小时。涂布于SD平板（含10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可过量表达膜蛋白细菌，其特征在于：该菌株为埃希氏大肠杆菌，命名为Escherichia coli1098‑3，保藏号为CGMCC No.8696，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种可过量表达膜蛋白细菌的应用，其特征在于：该菌株为埃希氏大肠杆菌，命名为Escherichiacoli1098-3，保藏号为CGMCCNo.8696，其16SrRNA序列如SEQIDNO：1所示；该菌株用于过量表达膜蛋白。2.根据权利要求1所述的一种可过量表达膜蛋白细菌的应用，其特征在于：具体方法如下：利用超表达载体携带外源膜蛋白基因序列，通过电击...
【专利技术属性】
技术研发人员：张中鸽，曹张军，
申请(专利权)人：东华大学，张中鸽，
类型：发明
国别省市：上海;31
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