重组人血管内皮抑素的诱导表达方法技术

本发明专利技术的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，将工程菌发酵至发酵液OD600值为10-15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h，即可。本发明专利技术的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，可满足重组人血管内皮抑素的大规模生产的需要，在较高菌体浓度下实现高效诱导表达。

【技术实现步骤摘要】
重组人血管内皮抑素的诱导表达方法
本专利技术属于重组人血管内皮抑素的提取纯化领域，具体涉及一种重组人血管内皮抑素的诱导表达方法。
技术介绍
人血管内皮抑素，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。实验表明，内皮抑素对血管内皮细胞、生长的血管可产生抑制作用，可对肿瘤的生长和转移起到较好的抑制作用。从其作用机理来讲，人血管内皮抑素是通过抑制人体内肿瘤组织的血液供应使肿瘤缺乏营养物质和氧气而停止生长、进而逐步萎缩直至死亡的，相较于目前临床普遍使用的化疗药物，具有无明显毒副作用的优点，因而受到了医学界的广泛关注。目前，人血管内皮抑素主要是先通过基因重组技术获得携带人血管内皮抑素基因的工程菌，再将工程菌表达目标蛋白经提取纯化而制备得到的。在重组人血管内皮抑素的提取纯化过程中，工程菌的发酵及诱导工程菌表达人血管内皮抑素，对能否获得较高的产品收率及较好的产品纯度的起到关键作用。中国专利文献CN154667A公开了一种重组人内皮抑素在大肠杆菌中的高效表达技术，将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coliBL21-Endo，接种于2ml、含60-90μg/mLKan的LB培养液中，36-38℃，200-250rpm振荡培养2-3h，使菌液OD600nm在0.4-0.6，向菌液中加入浓度为0.8-1.0mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在36-38℃下，180-200rpm继续振荡培养3-5h诱导内皮抑素的表达，表达量达到菌体总蛋白的38％。在工业的大规模生产中若采用上述方法，则需要耗费大量的培养基、培养液，以保持菌发酵液的菌体浓度处于较低水平，而提高菌体浓度，并同步提高诱导剂用量，则不仅会由于重组人血管内皮抑素的工程菌对诱导剂的耐受性迅速上升、敏感性显著下降，进而不可避免的出现诱导重组人血管内皮抑素蛋白的表达量下降的现象，无法获得较高的诱导表达量，同时，高浓度的菌体浓度下，也需要浓度较高的培养基、培养液，而菌体在这种环境下必然生长较快，养分易过早耗尽，进而造成菌体过早衰老而自溶，无法获得理想的表达量。无论哪一种情况，均意味着大规模生产中重组人血管内皮抑素的生产效率极低，会造成大量的原料耗费。因此，上述方法虽然表达量可以达到38％，但是，该表达量仅能在少量的培养液中、发酵液的OD600nm值在0.4-0.6之间的条件下实现，换而言之，上述方法仅能实现在小型实验中，低工程菌浓度下的高效诱导表达，进而获得极微量的产品，无法适用于工业化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中的重组人血管内皮抑素诱导表达方法不适用于工业大规模生产、生产效率较低，进而提供一种可满足重组人血管内皮抑素的大规模生产需要、在较高菌体浓度下实现高效诱导表达、发酵表达量高的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法。本专利技术的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，包括以下步骤：将工程菌发酵至发酵液OD600值为10-15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，培养2.5-3.5h，再向其中加入终浓度为0.1-0.3mmol/L的诱导剂IPTG，继续培养3-5h，即可。需要说明的是，所述碳源与氮源物质，其选择并不唯一，可提供菌体发酵过程中所需的碳、氮的物质均可。本专利技术中，所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。优选的，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L；所述酵母提取物的浓度为4-6g/L；所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L；所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。最优选的，所述碳源物质为13g/L的葡萄糖；所述氮源物质为5g/L的酵母提取物。所述诱导剂IPTG第一次加入使发酵液中IPTG的浓度为0.3mmol/L的量，第二次加入终浓度为0.2mmol/L的诱导剂IPTG。优选的，将所述工程菌发酵至发酵液OD600值为12.5后，向其中加入诱导剂IPTG。所述的工程菌发酵具体包括以下步骤：取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5-8％的接种量，接种至发酵培养基中，再发酵至OD600值为10-15。其中，所述LB培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L。所述发酵培养基包括：5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/LKH2PO4、10-20g/L葡萄糖。本专利技术的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：(1)本专利技术所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，在工程菌发酵至OD600值为12.5后，向其中加入诱导剂IPTG，在30-37℃下，培养2.5-3.5h后，再向其中加入诱导剂IPTG。将现有技术中的诱导剂一次性添加改为了分两次添加，可有效的避免由于菌体对诱导剂耐受性上升、敏感性下降而造成的重组人血管内皮抑素的表达量下降。尤其是，IPTG诱导剂在上述两个时机分别以0.2-0.4mmol/L发酵液以及0.1-0.3mmol/L发酵液的用量加入，其诱导效果较为理想，同时，结合在第一次加入诱导剂后加入碳源物质及氮源物质，可避免在发酵初期采用高浓度培养基、培养液而造成的菌体过早衰老，也及时补充了菌体所需的养分，保证了两次的诱导剂加入均能实现良好的诱导效果。经实验表明，采用上述方法，可在OD600值为10-15的高菌体密度下，实现诱导重组人血管内皮抑素的总表达量达30％以上，满足了重组人血管内皮抑素的大规模生产要求。(2)本专利技术所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，采用的所述发酵的培养基包括：5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/LKH2PO4、10-20g/L葡萄糖。上述发酵培养基可较好的保证菌体在发酵时所需的物质，尤其是，与发酵过程中第一次加入诱导剂时加入的碳源物质及氮源物质相互配合，实现了更好的发酵及诱导表达效果。具体实施方式实施例1本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD600值为12.5，然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及5g/L的氮源物质酵母提取物，在30℃下，培养2.5h，再向其中加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养4h，即可。其中，所述发酵培养基由10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、1g/LKH2PO4、10g/L葡萄糖组成。实施例2本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5％的接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD600值为10，然后，向其中加入2.49g的诱导剂IPTG、15g/L的碳源物质葡萄糖、以及6g/L的氮源物质酵母提取物，在34℃下，培养3h，再向其中加入3.75g的诱导剂IPTG，继续培养3h，即可。其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：将工程菌发酵至发酵液OD600值为10‑15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2‑0.4mmol/L，在30‑37℃下，对工程菌培养2.5‑3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1‑0.3mmol/L，继续培养3‑5h，即可。

【技术特征摘要】
1.重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：将工程菌发酵至发酵液OD600值为10-15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，对工程菌培养2.5-3.5h，再向其中加入终浓度为0.1-0.3mmol/L的诱导剂IPTG，继续培养3-5h，即可。2.根据权利要求1所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，其特征在于，所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L；所述酵母提取物的浓度为4-6g/L；所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L；所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。4.根据权利要求1-3任一所述的重组人血管内皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣志刚，姚建林，赵唯一，黄佩华，朱浩文，陈卫，崔志远，徐霞，
申请(专利权)人：江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂，
类型：发明
国别省市：江苏;32