具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针制造技术

本发明专利技术描述了用于检测靶核苷酸序列中多态性的探针和方法，所述多态性包括短串联重复序列。所述探针包括由接头序列分开的第一和第二区域，所述第一和第二区域具有分离的与其各自靶序列的解链温度。在第一个实施方案中，所述第一和第二区域都是报告子序列；在第二个实施方案中，一个区域是锚定序列，而另一个是报告子序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有多个靶区域特异性和具有分为三部分特征的探针专利
本专利技术涉及检测靶核酸序列的核酸探针，和更特别地涉及从基因组的或扩增的DNA检测变体核酸序列的探针。本专利技术的进一步方面涉及检测变体核酸序列的方法。专利技术背景核酸探针经常用于鉴别基因组的或扩增的DNA中特定靶序列的存在。探针对靶的退火或解链温度受探针和靶共有的互补区域的长度和另外的互补碱基对之间的任何错配的存在影响。这可以用于检测变体，例如SNP或多重复的存在。探针可以设计为具有对野生型序列的第一解链温度(Tm)，并监测探针对靶的退火(例如通过在退火时形成荧光)。如果Tm不同于预期值，那么靶序列包括变体。然而，用较长的探针区域实施该过程可能是困难的。尤其，长探针可能不提供野生型和变体序列之间Tm方面的足够变化。本专利技术意在解决常规探针具有的这些和其它缺点。US2007/0065847描述了一组用普通序列标记的核苷酸探针用作标签。所述探针用于探测化合物文库。WO2011/027966描述了具有第一和第二区域的探针，所述第一区域包括报告子分子并且所述第二区域包括猝灭子分子。当探针杂交于靶时，核酸外切酶可以从猝灭子切割报告子，导致信号检测。当存在错配以致报告子部分未被杂交时，所述报告子不被切割，并且不存在信号检测。WO2007/058499描述了用于呼吸道病毒的探针，所述探针具有由分离部分分开的第一和第二杂交部分。US2007/0259347描述了用于筛选阵列的探针，所述探针具有由接头分开的两部分，其中选择接头部分以最小化与杂交相关的同源性噪声(homologynoise)。US2003/0170711描述了包括通用碱基(包括2-脱氧肌苷)的寡核苷酸探针。WO2011/087928描述了用于在野生型序列背景中检测KRAS和PIK3CASNP的寡核苷酸探针，所述探针包括多脱氧肌苷接头。专利技术概述根据本专利技术的第一个方面，提供一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头将第一和第二序列两个分开，以致与第一靶核酸序列退火的第一序列的解链温度和与第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度是分离的(discrete)。接头区域的存在让探针分为具有不同杂交特征的功能性元件。这些接头的包含产生'泡'结构，从热力学的视角分离探针的元件，以提供具有不同结合特性的区域。进一步的，接头核酸序列的存在让整个探针具有单个多核苷酸分子的特性，但表现如由分开的更短核酸探针组成。当第一和第二序列杂交于其各自的靶序列时，接头区域可以折叠形成外环(loopout)。在一些实施方案中，探针可以进一步被延伸以具有进一步的由多个接头分开的多杂交区域。这可以以许多不同方式使用。例如，所述探针结构允许探测邻近的区域，其中较长的探针(例如，横跨第一和第二靶区域二者的单个探针)通过Tm分析将不提供足够的报告信息以区分变体。优选地，所述接头是核苷接头；更优选地，所述接头包括多脱氧核糖核苷酸；最优选地，所述接头包括多脱氧肌苷或由多脱氧肌苷组成。由于较弱的氢键，脱氧肌苷具有相对于天然碱基低的解链温度。可以使用其它核苷。优选地，所述接头长度达5，10，15，20，30，40，50个核苷酸。第一和第二核酸序列的至少一个是报告子区域。报告子区域包括标记的部分；优选荧光标记。这允许在结合靶序列时检测探针，和在一个温度范围监测退火以确定任何变体靶序列的存在。优选地，所述探针不包括猝灭部分，也不包括意在与猝灭子一起使用的标记。合适的标记包括FAM，TET，HEX，ROX，TAMRA，Cy3，和Cy5。其它合适的标记将是熟练技术人员已知的。尽管可以使用任何合适的核苷酸，但是优选地所述标记被整合在T核苷酸上。所述报告子区域长度优选15-200nt，长度更优选15-150，还更优选15-100，或20-100，30-80，40-60，或大约50nt。所述报告子区域设计为具有与完全互补靶序列相关的第一Tm，和改变的、优选与变体靶序列相关的较低Tm。例如，所述变体可以表示SNP(单核苷酸多态性)，插入，缺失，倒位，或重复序列。在该实施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解链温度可以不同于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解链温度。然而，优选地，第一和第二核酸序列二者都选择为具有对其各自的靶序列相似的Tm。所述报告子区域可以进一步包括阻断区域(blockingregion)；即，用于阻止通过DNA聚合酶的核酸链的延伸，从而阻止在例如，PCR过程中的链延伸的部分。聚合酶酶阻断基团是应该具有阻断聚合物的进一步延长功能性质的基团。阻断基团可以是任何能够连接于核苷酸的化学基团，其将允许修饰的核苷酸的5'端连接于DNA链中另一个核苷酸的3'端但将不允许核苷酸连接于修饰的核苷酸的3'羟基基团。适当地，3'位置OH基团的缺失将阻止通过聚合酶活性的进一步延伸。在一个特别优选的实施方案中，阻断基团选自乙酰基，CH3，甘氨酰基，亮氨酰基和丙氨酰基基团。在另一个实施方案中，所述阻断基团可以是二或三肽的形式。在本专利技术的一个实施方案中，第一和第二核酸序列都是报告子区域。它们可以包括不同标记。此种探针可以用作多重报告子，允许用单个探针在扩展的范围内检测靶序列。在该实施方案中，所述探针被分为多个分离的报告子区域。每个报告子区域具有不同退火温度并且具有1个或更多荧光核苷酸，优选FAM-T，或不同/多个颜色。所述报告子可以用于报告特定的序列或序列变体，SNP，插入，缺失等的存在。这将允许用单个探针在扩展的范围内检测多个序列。每个区域被调整为在野生型靶序列的情况下具有相似的Tm，但在突变的情况下具有改变的Tm；这意味着使用者仅必须检测改变的Tm以知晓变体存在。作为检测多个靶序列的备选方案，可以将探针构造以例如提供控制结合区域和测试结合区域，用以改善测定的可信度。在本专利技术的一个备选实施方案中，第二核酸序列可以是报告子区域，并且第一核酸序列是锚定区域。在该实施方案中，退火于第一靶核酸序列的第一序列的解链温度高于退火于第二靶核酸序列的第二序列的解链温度。接头序列可以形成外环区域或可以杂交于任何探针内部的(inter-probe)核酸序列。锚定区域对靶序列的Tm显著高于(高出至少0.5，1，1.5℃，但更通常可达5℃至20℃)报告子区域与靶序列的Tm。锚定区域长度优选为至少50nt，更优选至少60，70，80，90，100，125，150nt。锚定区域长度优选为不多于200nt和长度不少于20nt。在使用中，因为锚定区域具有基本上更高的退火温度，因此其用于将探针锚定于正确的区域。报告子区域具有相对于锚定区域更低的退火温度并且具有1个或更多荧光核苷酸，优选FAM-T。报告子是用于报告特定序列或序列变体，SNP，插入，缺失等的存在。在优选的实施方案中，探针用于检测大小/长度多态性，例如STR分布(profiling)，脆性X染色体(FragileX)等。锚定区域用于退火于重复区域的下游，同时报告子区域同源于重复序列的短延伸。因为报告子与主要的锚定区域分开，和因为荧光团仅在报告子区域上，因此，如果报告子在不同位点结合而引起扩增子中形成外环(通常这将改变产物的Tm，使得难以测量)，也本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一核酸序列；与第二靶核酸序列互补的第二核酸序列；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头分开所述第一和第二序列两个，以致与所述第一靶核酸序列退火的第一序列的解链温度和与所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度是分离的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.19 GB 1116131.21.一种核酸探针，其包括与第一靶核酸序列互补的第一锚定核酸序列；包含与第二靶核酸序列互补的第二核酸序列的报告子区域；和连接第一和第二核酸序列的接头核酸序列；其中所述接头分开所述第一和第二序列两个，以致与所述第一靶核酸序列退火的锚定序列的解链温度和与所述第二靶核酸序列退火的报告子序列的解链温度是分离的；并且其中与所述第一靶核酸序列退火的锚定序列的解链温度高于与所述第二靶核酸序列退火的第二序列的解链温度，并且所述报告子序列包括串联重复序列。2.如权利要求1所述的探针，其中所述接头包括多脱氧核糖核苷酸。3.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头包括多脱氧肌苷或由多脱氧肌苷组成。4.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达5个核苷酸。5.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达10个核苷酸。6.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达15个核苷酸。7.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达20个核苷酸。8.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达30个核苷酸。9.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达40个核苷酸。10.如权利要求1或2所述的探针，其中所述接头的长度为多达50个核苷酸。11.如权利要求1或2所述的探针，其中所述报告子区域包括标记的部分。12.如权利要求11所述的探针，其中所述标记的部分是荧光标记。13.如权利要求1或2所述的探针，其中所述探针不包括猝灭部分。14.如权利要求12所述的探针，其中所述报告子区域的长度为15-200nt。15.如权利要求14所述的探针，其中所述报告子区域的长度为15-150nt。16.如权利要求15所述的探针，其中所述报告子区域的长度为20-100nt。17.如权利要求15所述的探针，其中所述报告子区域的长度为30-80nt。18.如权利要求15所述的探针，其中所述报告子区域的长度为40-60nt。19.如权利要求15所述的探针，其中所述报告子区域的长度为50nt。20.如权利要求12所述的探针，其中所述报告子区域被设计为具有与完全互补靶序列相关的第一Tm，和改变的与变体靶序列相关的Tm。21.如权利要求20所述的探针，其中所述改变的与变体靶序列相关的Tm低于所述与完全互补靶序列相关的第一Tm。22.如权利要求1或2所述的探针，进一步包括阻断区域，所述阻断区域用于阻断通过DNA聚合酶的核酸链的延伸。23.如权利要求1或2所述的探针，其中锚定区域：第一靶序列双链体的Tm比报告子区域对第二靶序列的Tm高至少0.5℃。24.如权利要求1或2所述的探针，其中锚定区域：靶序列双链体的Tm比报告子区域对第二靶序列的Tm高至少1℃。25.如权利要求1或2所述的探针，其中锚定区域：靶序列双链体的Tm比报告子区域对第二靶序列的Tm高至少1.5℃。26.如权利要求1或2所述的探针，其中锚定区域：靶序列双链体的Tm比报告子区域对第二靶序列的Tm高5至20℃。27.如权利要求1或2所述的探针，其中所述锚定区域的长度是至少50nt。28.如权利要求27所述的探针，其中所述锚定区域的长度是至少60nt。29.如权利要求27所述的探针，其中所述锚定区域的长度是至少70nt。30.如权利要求27所述的探针，其中所述锚定区域的长度是至少80nt。31.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：本·科布，
申请(专利权)人：艾皮斯托姆有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB