本发明专利技术涉及一种猪蓝耳病(繁殖与呼吸系统综合症，PRRSV)蛋白工程疫苗的制备与应用。所述疫苗以PRRSV主要结构蛋白GP5和次要结构蛋白GP3、GP4的体液和细胞免疫表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与Thelper表位串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组蓝耳病蛋白工程疫苗。本发明专利技术还涉本发明专利技术还涉及该疫苗的使用方法。动物实验表明，蓝耳病蛋白工程疫苗的攻毒保护力与弱毒苗相当，高于灭活苗，可以产生快速有效的免疫反应，预防猪蓝耳病病毒的感染。
【技术实现步骤摘要】
一种蓝耳病蛋白工程疫苗的制备
本专利技术属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪蓝耳病蛋白工程疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白GP3、GP4、GP5抗原表位串联并在框架结构中加入Thelper表位,克隆入大肠杆菌载体,转化宿主菌,经过发酵,纯化、乳化工艺制备，得到重组蓝耳病蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病猪蓝耳病中的应用。
技术介绍
猪生殖和呼吸综合征(PorcineReporductive and Respiratory Syndrome, PRRS),又称蓝耳病(Blue ear diesase)是由动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRVS)引起的一种新的病毒性传染病，是一种以导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的新病。1987年该病首次报道于美国，随后在北美、欧洲及亚洲各国和地区迅速蔓延，目前已成为一种地方性流行病(DeaSetal，1991 ;殷震等，1985 ；LoulaT, 1991 ；ShimizuM etal.，1994 ；Lindhausff etal.，1991.)。1996年，我国郭宝清首次分离到病毒(北美型经典毒株)，证实我国也存在此病(郭宝清等，1996)，之后我国相继有20多个省份报道发生了该病的流行(Tian K G et al.，2007 ;田克恭等2008 ;金宁一，2008)，尤其是2006年下半年来，我国有25个省份发生了以高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)为主要病原的“猪高热病”。各地高致病性PRRSV变异株有以下特点:传播迅速，毒力增强，致病力相似；对中小养殖场和农户危害严重；分子特征一致，起源于同一祖先。对全国各地分离的高致病性猪蓝耳病病毒毒株，通过完整的ORFS和部分Nsp2基因序列比较分析发现来自不同猪场的HPPRRSV高度同源，而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失:Nsp2基因的第483位和535-563位氨基酸发生缺失(童光志等，2007 ;郝晓芳等，2007)。而与2005 年以前的PRRSV的Nsp2同源性仅为69.886.2%。新分离毒株的GP5基因相互之间也是高度同源(98.5% -100.0% )，与以前的PRRSV毒株相比变异也比较大，尤其是两个潜在的认为与病毒毒力相关的氨基酸(R13 — Q13and R151 — G151) (Madsenet al.,1998 ；Yang et al.，1998 ；Allende et al.，2000)。目前，对该病尚无有效的治疗方法，疫苗免疫虽然能在一定程度上减轻疫情的严重情况，仍在疫苗的选用上存在不少问题；蓝耳病在我国广泛的流行给养猪业带来了巨大的损失，因此研制有效控制该病的疫苗是当务之急。更加有效的PRRSV疫苗的开发存在三个主要问题:⑴对于免疫系统PRRSV可能诱导反相调节信号，在结构蛋白中存在极大的抗原变异性，因此，免疫保护并未完全搞清楚。⑵正如(I)所示，PRRSV异源二聚体GP5-M肯定是体液免疫和细胞免疫反应的主要诱导蛋白；(3)然而，次要结构蛋白对于PRRSV病毒粒子的感染性也是必要的(Wissink etal.，2005)，也可以起到保护作用，而且诱导T细胞保护反应表明其也具有有限的T细胞表位(Mateuand Diaz, 2008)。PRRSV包括3个主要结构蛋白GP5 (E)、GP6 (M)和GP7 (N)以及次要结构蛋白GP2、GP3、GP4。研究结果表明，GP2在病毒中含量少，免疫原性差并且在实际操作中难以分离提纯；GP3主要诱导机体细胞免疫；GP4、GP5 (E)和GP6 (M)均可诱导机体产生中和抗体，其中GP5有6个抗原决定簇，是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性((Lopez and Osorio, 2004 ；Tong et al., 2009)，GP5还可诱导细胞凋亡。核衣壳蛋白(N)免疫原性强，但产生的抗体无中和活性，主要用于免疫诊断，是检测病毒抗体的良好抗原。Yoon等的研究发现，向猪体内被动输入高滴度中和抗体可以预防本病(Yoon KJ et al., 1996),而且母猪在输入高滴度中和抗体后可免于出现繁殖障碍(OsorioFAet al.，2002)。这说明，单体液免疫即可有效预防PRRSV。猪感染PRRSV后，最7d即可检测到特异性抗体。在整个感染期问，均能检测出结构蛋白和非结构蛋白(尤其是Nsp2)抗体(Meulenberg JJ et al., 1995 ；Nelson EA et al., 1994 ；01eksiewica MB et al., 2002 ；ffuWH et al.，2001)，有关PRRSV的免疫保护机制还没有完全阐明，体液免疫和细胞免疫均可发挥作用。GP3蛋白由0RF3编码的一种高度糖基化蛋白。GP3蛋白共有7个N-糖基化位点，且这些糖基化位点在不同分离株间非常保守(Gonin et al.，1998 ；Katz et al.，1995)。GP3在动脉炎病毒糖蛋白中的位置比较特殊，它的膜拓扑结构还在推测中，而且它在病毒粒子中的结构特征还存在争议(Hedges et al.，1999 ；ffieringa et al.，2002) XP3 是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，GP3可能与诱导细胞免疫有关，对猪产生保护作用(Plana-Duranet al.，1997)。GP3在欧美型毒株间推导氨基酸的同源率为54%~60%而且多数变异发生在其N末端，但GP3的N端潜在的糖基化位点及疏水性仍是保守的。另外，与LV相比，北美型毒株的GP3中C端的推导氨基酸有12个残基的缺失。0RF3和0RF4的重叠区有一疏水的高变区，即GP4的N端存在这样一个高变区。据报道，LV的这个高变区含有一个推测的中和位点，其中由9个氨基酸构成的基元(59-67)构成了此中和位点的核心，此处的突变可造成GP4蛋白的抗原性发生改变(Meulenberg JJ et al.，1997)。基质蛋白(M)和GP5糖蛋白是囊膜的主要成分，M和GP5构成异二聚体。从欧洲LV株上还分离出囊膜糖蛋白GP3，但是在北美IAF-Klop株的GP3是一种可溶性蛋白且与囊膜结合能力较弱(Dea, Set al., 2000) 0 GP4蛋白的分子量为31~35KD，有4个糖基化位点，为N-糖基化蛋白，是病毒的主要结构蛋白之一。GP4蛋白有一个可以被单抗中和的抗原决定簇，它位于该蛋白胞外区第40~79位氨基酸之间。该区域在不同的PRRSV中高度可变，它可能和免疫选择相关。已证实LV病毒的GP4蛋白诱导的抗体具有中和作用(Meulenberget al.，1997)，说明这个蛋白质至少有部分暴露在病毒粒了的表面。虽然GP4蛋白具有中和表位，但GP4抗体的出现与血清的中和抗体效价似乎无相关性(Zhang etal.,1998)。Yoo等(2005)认为GP4在信号转导和介导脂质双层漂移中发挥作用。Meulenberg等在LV株的0RF4编码蛋白GP4中鉴定了一个中和区，表明该蛋白诱导的抗体具有中和作用，但是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蓝耳病蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
1.一种蓝耳病蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDN0.2。2.—种核酸分子，其编码权利要求1项所述融合蛋白。3.—种载体,其含有权利要求2所述的核酸分子。4.一种宿主细胞,其含有权利要求3所述的载体。5.权利要求2所述的核酸分子，其具体序列如下:gcaaagttcgttgcagcatggaccctgaaagcagcagcaatctccgagatcaagggtgtcarcgtccacaagatcgaggggatcggttctggtatagggcatgaccgatgtagtgagaacgatcatgacgaactagttcacgacggggataacgccaccttgcctcgccatgacaatattgtctttcggacatcaaaaccaacaccaccgcagcatcagggttctggtccatgtttcagttcgagcctttcggacatcaaaaccaacacctccgcagcatcagacttcgttgtcctccaggacatcagctgccttaggcatggcgactcgtcccctccgacggttcgcaaaatccctcagtgccgctct...
【专利技术属性】
技术研发人员：李殿明，蒲勤，李毅，齐春梅，田春辉，任百亮，张导春，刘甜甜，顾富香，
申请(专利权)人：青岛宝麦德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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