本发明专利技术涉及一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法。采用的技术方案是：1)犬全基因组DNA的获取；2)CfOR0041基因和CfOR0149基因片段的PCR扩增与纯化；3)单向延伸引物进行CfOR0041-SNP-632-C/T、CfOR0041-SNP-770-A/T、CfOR0149-SNP-506-G/A位点的PCR扩增与纯化，SAP消化PCR扩增体系中多余的dNTPs；4)毛细管电泳；5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性。本发明专利技术通过德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型的检测来实现在DNA水平精确地对德国牧羊犬嗅觉灵敏性的判定。
【技术实现步骤摘要】
一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法
本专利技术涉及一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，特别涉及一种通过单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳的检测、实现对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型精确判定的有效方法。
技术介绍
警犬技术工作在多项公安工作中发挥着积极、不可替代的特殊作用。选取嗅觉灵敏的犬警用是警犬技术工作迫切需要解决的问题。动物的嗅觉评估方法很多，包括行为学、影像学、电生理学、组织形态学等多种类型。行为学方法对动物的嗅觉评估操作简单、但客观性保障要求较高:具备质量控制的实验设计、个体差异影响评估结果、样本量大、往往需对动物进行预先训练等。同时，嗅觉功能的客观评估方法如影像学、电生理学、组织学等测量方法，由于其初期投入较大，对硬件及技术条件要求较高，目前普遍开展难度较大。例如，组织学检查方法的活体获取检材困难、在灵敏嗅觉犬的选取中可操作性差；电生理学方法中嗅电图仅限于对嗅区粘膜细胞电位变化的检查、对于粘膜后传导通路没有评估价值；嗅觉脑电图因产生机制不明确、特异性不高而应用更少；嗅觉诱发电位证明嗅觉传导通路是否畅通、暂不适合嗅觉定性评估；嗅觉系统功能影像检查的功能磁共振检查需在动物麻醉的情况下实施；脑功能光学成像确切的生理意义还不明确等。因此，需要一种简单易行、技术成熟、实用价值强的方法对犬嗅觉功能进行全面、客观、效果肯定的判定方法出现。
技术实现思路
针对现有犬嗅觉功能评估方法客观性不足或实用价值不强的现状，本专利技术提供一种新型的通过单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法、实现对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型精确检测，从而判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的有效方法，以解决犬嗅觉灵敏性评估方法方面的技术问题。本专利技术采用的技术方案是:一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，步骤如下:I)犬全基因组DNA的获取:选用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集犬前肢臂头静脉血2ml、使用试剂盒提取犬全血基因组DNA，检测DNA浓度与纯度，挑选0D260/0D280值在1.8~2.0之间、DNA浓度≥0.5ug/ul的样本于_80°C保存、待用。2)犬嗅觉受体基因的PCR扩增与纯化:取犬全基因组DNA作为PCR扩增模板，分别以Cf 0R0041基因的特异性引物和CfORO149基因的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增、分别获得含有待检测SNP位点的Cf0R0041基因片段的PCR产物和CfORO149基因片段的PCR产物；将获得的PCR产物进行纯化；所述的Cf0R0041基因的特异性引物的序列是:F:5’ -CTGGCCTGTGGAACTGATGT-3’ ；R: 5，-CAGGAGCTCTGGGGATAGAG-3，；所述的Cf0R0149基因的特异性引物的序列是:F:5’ -CTCTCTTGGGCAACAGCACT-3’ ；R: 5，-CAGCACGGCCAGAATTTCAC-3，；PCR扩增体系是:PCR总反应体系为25ul:Premixl2.5ul ；上下游引物各0.5ul (浓度IOuM)；DNA 模板 Iul (500ng/ul)；其余用超纯水补足；PCR反应条件为:94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸45s，35个循环，4°C保存。3)单向延伸引物的PCR扩增与纯化:以步骤2)纯化后的Cf0R0041基因片段的PCR产物片段为模板，分别以单向延伸引物 Cf0R0041-SNP-632-C/T-F 和 Cf0R0041-SNP-770-A/T-F 为引物，进行单向延伸 PCR 扩增；引物Cf0R0041-SNP-632-C/T-F:5，-GGTGTGGGGCTGGTGTGCATCACTG-3，；引物Cf0R0041-SNP-770-A/T-F:5’ -MMMMMCCCACCTCACTGTGGTGGTCGTGCACT-3’ ；以步骤2)纯化后的Cf0R0149基因片段的PCR产物片段为模板，以单向延伸引物Cf0R0149-SNP-506-G/A-R为引物，进行单向延伸PCR扩增；引物Cf0R0149-SNP-506-G/A-R:5，-AAAAAATCACACGTGAAGTGATCGATGAGATTCCTA-3，；将获得的单向延伸PCR扩增产物分别经虾碱酶(SAP)消化体系，消化多余的dNTPs ；单向延伸PCR扩增体系是:PCR总反应体系为5ul =Premixlul ；单向延伸引物0.5ul (浓度IuM);DNA 模板 Iul ；其余用超纯水补足。PCR反应条件为:96°C变性10s，50°C退火10s，72°C延伸30s，25个循环，4°C保存。SAP消化反应体系是:SAP消化总反应体系为5ul:DNA模板4.25ul ；Buffer0.5ul ；SAP0.25ul。SAP 消化反应条件:37°C 变性 lh，80 °C 15min。4)毛细管电泳:将经虾碱酶消化后的单向延伸引物的PCR扩增产物0.5ul、DNA SIZE STD800.5ul、SLS39ul混合均匀后移入上样96孔板、添加一滴矿物质油封盖样品液面；对应缓冲液96孔板添加3/4孔体积缓冲液，选取SNP-1模块、50°C的条件下电泳，进行毛细管电泳检测。 5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试德国牧羊犬嗅觉灵敏性:单向延伸弓丨物Cf0R0041-SNP~632~C/T-F 的 PCR 单向扩增产物出现 Cf0R0041-SNP~632~C/T位点基因型为CC (黑色单峰)、且单向延伸引物Cf0R0041-SNP-770-A/T-F的PCR单向扩增产物出现Cf0R0041-SNP-770-A/T位点基因型为M(红色单峰)、且单向延伸弓丨物CfORO 149-SNP-506-G/A-R的PCR单向扩增产物出现Cf0R0149-SNP-506~G/A位点基因为GG(黑色单峰)，则判定待测德国牧羊犬具备灵敏嗅觉。检测结果非前述三种基因型的受试德国牧羊犬则判定嗅觉灵敏性差。本专利技术中，Cf0R0041-SNP-632-C/T位点基因型 CC、Cf0R0041-SNP-770-A/T 位点基因型AA、Cf0R0149-SNP-506-G/A位点基因GG在毛细管电泳图上分别呈现黑色、红色、黑色单峰产物。Cf0R0149-SNP-506-G/A位点基因GG，由于单向延伸引物为下游反向引物，故毛细管电泳图呈黑色单峰产物CC指示受试犬基因型为GG。通过电泳峰值图可以精确检测受试德国牧羊犬基因型、判定受试德国牧羊犬的嗅觉灵敏性。本专利技术的有益效果是:本专利技术采用单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法、实现对德国牧羊犬嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型精确检测，从而判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的有效方法，相对于国际上一般使用的动物嗅觉评估方法，如行为学、影像学、电生理学、组织形态学等多种类型的实验方法而言，能够更加精确地在DNA水平通过检测德国牧羊犬机体内嗅觉灵敏性相关嗅觉受体基因型，依此来评估德国牧羊犬嗅觉灵敏性。由于犬嗅认能力受遗传影响的原因，第三代遗传标记SNP决定的嗅觉受体基因型已成为决定犬嗅觉灵敏性的重要指标。而本专利技术通过单向延伸引物PCR扩增产物的毛细管电泳方法，实现在DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，其特征在于步骤如下：1)犬全基因组DNA的获取；2)犬嗅觉受体基因片段的PCR扩增与纯化：取犬全基因组DNA作为PCR扩增模板，分别以CfOR0041基因的特异性引物和CfOR0149基因的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增、分别获得CfOR0041基因片段的PCR产物和CfOR0149基因片段的PCR产物；将获得的PCR产物分别进行纯化；所述的CfOR0041基因的特异性引物序列是：F:5’‑CTGGCCTGTGGAACTGATGT‑3’； R:5’‑CAGGAGCTCTGGGGATAGAG‑3’；所述的CfOR0149基因的特异性引物序列是：F:5’‑CTCTCTTGGGCAACAGCACT‑3’； R:5’‑CAGCACGGCCAGAATTTCAC‑3’；3)单向延伸引物的PCR扩增与纯化：以步骤2)纯化后的CfOR0041基因片段的PCR产物为模板，分别以单向延伸引物CfOR0041‑SNP‑632‑C/T‑F：5’‑GGTGTGGGGCTGGTGTGCATCACTG‑3’、CfOR0041‑SNP‑770‑A/T‑F：5’‑AAAAAAAAAACCCACCTCACTGTGGTGGTCGTGCACT‑3’为引物，进行单向延伸PCR扩增；以步骤2)纯化后的CfOR0149基因片段的PCR产物为模板，以单向延伸引物CfOR0149‑SNP‑506‑G/A‑R：5’‑AAAAAATCACACGTGAAGTGATCGATGAGATTCCTA‑3’为引物，进行单向延伸PCR扩增；将上述获得的单向延伸PCR扩增产物分别经虾碱酶消化体系、消化多余的dNTPs；4)毛细管电泳：分别将经虾碱酶消化后的单向延伸引物的PCR扩增产物0.5ul、DNA SIZE STD800.5ul、SLS39ul混合均匀后移入上样96孔板、添加一滴矿物质油封盖样品液面；对应缓冲液96孔板添加3/4孔体积缓冲液，选取SNP‑1模块、50℃的条件下电泳，进行毛细管电泳检测；5)遗传分析系统进行基因型分析，判定受试犬嗅觉灵敏性：遗传分析系统进行基因型分析，判定CfOR0041‑SNP‑632‑C/T位点的基因型为CC、且CfOR0041‑SNP‑770‑A/T位点的基因型为AA、且CfOR0149‑SNP‑506‑G/A位点的基因为GG的受试犬嗅觉灵敏，否则嗅觉灵敏性差。...
【技术特征摘要】
1.一种在DNA水平精确判定德国牧羊犬嗅觉灵敏性的方法，其特征在于步骤如下: 1)犬全基因组DNA的获取； 2)犬嗅觉受体基因片段的PCR扩增与纯化: 取犬全基因组DNA作为PCR扩增模板，分别以Cf0R0041基因的特异性引物和Cf0R0149基因的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增、分别获得Cf0R0041基因片段的PCR产物和Cf0R0149基因片段的PCR产物；将获得的PCR产物分别进行纯化； 所述的Cf0R0041基因的特异性引物序列是:F:5’ -CTGGCCTGTGGAACTGATGT-3’ ；R:5， -CAGGAGCTCTGGGGATAGAG-3，； 所述的Cf0R0149基因的特异性引物序列是:F:5’ -CTCTCTTGGGCAACAGCACT-3’ ；R:5， -CAGCACGGCCAGAATTT CAC-3，； 3)单向延伸引物的PCR扩增与纯化: 以步骤2)纯化后的Cf0R0041基因片段的PCR产物为模板，分别以单向延伸引物Cf0R0041-SNP-632-C/T-F:5’ -GGTGTGGGGCTGGTGTGCATCACTG-3’、Cf0R0041-SNP-770-A/T-F:5’ -AAAAAAAAAACCCACCTCACTGTGGTGGTCGTGCACT-3’ 为引物，进行单向延伸 PCR 扩增； 以步骤2)纯化后的Cf0R0149基因片段的PCR产物为模板，以单向延伸引物Cf0R0149-SNP-506-G/A-R:5’ -AAAAAATCACACGTGAAGTGATCGATGAGATTCCTA-3’ 为引物，进行单向延伸PCR扩增； 将上述获得的单向延伸PCR扩增产物分别经虾碱酶消化体系、消化多余的dNTPs ； 4)毛细管电泳: 分别将经虾碱酶消化后的单向延伸引物的PCR扩增产物0.5ul、DNA SIZE STD...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨敏，刘成武，南会林，张汇东，刘庆，
申请(专利权)人：公安部警犬技术学校，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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