甘草中抗肿瘤活性物质、提取方法及其应用技术

甘草中抗肿瘤活性物质、提取方法及其应用，属于生物医药技术领域。它由甘草香豆酮、甘草吡喃香豆素和甘草异黄酮组成。方法：一、甘草水提液GC-1的制备；二、分离甘草抗肿瘤有效部位GC-2；三、分离甘草抗肿瘤有效部位GC-3；四、分离甘草抗肿瘤活性物质GC-4；五、分离甘草抗肿瘤活性物质GC-5。应用：它用于体外诱导人宫颈癌Hela细胞和人胃癌SGC-7901细胞凋亡。本发明专利技术采用多种分离方法，对甘草进行分离、提取，得到甘草抗肿瘤活性物质GC-5，并对该物质进行了系统的抗肿瘤活性的测定，证明该物质具有体外诱导人胃癌SGC-7901细胞和人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用，且有效作用剂量低、抗肿瘤作用明显。

【技术实现步骤摘要】
甘草中抗肿瘤活性物质、提取方法及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及甘草中抗肿瘤活性物质、提取方法及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤是危害人类健康的最严重疾病之一，其中宫颈癌和胃癌对人类的危害较为严重。宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中位于第二位，仅次于乳腺癌。据WHO数据统计，2002年全球估计有49.3万的宫颈癌新发病例，我国每年新发病例13.15万，约占世界宫颈癌新发病例的28.8％。胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据2000年资料统计，全球每年新发胃癌876000例，占所有新发癌症病例的9％，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居第4位。2008年世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)的肿瘤检测数据显示，在死因顺位中胃癌仅次于肺癌，位居第2位，占9.7％。我国的胃癌发病率、死亡率位居全球较高水平，位列我国恶性肿瘤发病率第1位，死亡率第3位。而目前化疗对于胃癌和宫颈癌是最常用的治疗手段，但多存在有效率低、副作用大、易复发等问题。甘草为豆科(Zeguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物的根和根状茎，主产于内蒙古、甘肃、新疆等地。我国最早的本草书籍《神农本草经》将其列为上品，是一味大众常用的中草药。目前，先后从甘草属植物中提取、分离、鉴定了206种化学成分。近年对甘草黄酮类化合物抗肿瘤作用的研究成为医药界观注的新焦点，但相关报道中的化学成分的有效作用剂量较大，并没有找到一种有效作用剂量低、效果好的抗肿瘤成分，并且缺乏抗肿瘤机制的系统性研究。特开昭63-218670的专利中公开了仅指出了甘草香豆酮有抗菌、抗氧化、抑制黄嘌呤氧化酶、抑制单胺氧化酶的作用，没有提及于抗肿瘤相关的信息。另有研究发现甘草香豆酮有诱导U937细胞凋亡的作用，但是没有对其内在机制进行深入研究，更未提及诱导人宫颈癌Hela细胞和人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用的研究。
技术实现思路
本专利技术目的是提供甘草中抗肿瘤活性物质、提取方法及其应用。甘草中抗肿瘤活性物质，它按质量份数由0.5～1份的甘草香豆酮、0.5～1份的甘草吡喃香豆素和0.5～1份的甘草异黄酮组成。甘草中抗肿瘤活性物质的提取方法，按以下步骤进行的：一、甘草水提液GC-1的制备：取甘草1000g经过筛除尘后，用自来水清洗4～6遍，然后用蒸馏水清洗2～4遍，再加蒸馏水至液面高出甘草8～12cm，浸泡12h，次日于文火100℃煮沸，2h后趁热用脱脂棉过滤，药渣重复提取1次，然后用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，于100℃蒸发浓缩至1.00mg/ml，制成甘草水提液，经三日间歇平压灭菌法灭菌，每次40min，置4℃冰箱保存备用，标记为GC-1；二、乙醇沉淀法初步分离甘草抗肿瘤有效部位GC-2：取3.5ml的GC-1置于塑料离心管中，然后向其中分段加入无水乙醇，并不断震荡，直至乙醇体积达到90％为止，将离心管置4℃冰箱12h后，于低温离心机4℃，4000r/min离心15min，收集沉淀，加蒸馏水溶解沉淀，滤纸过滤，减压浓缩至1.00mg/ml，置于4℃冰箱保存备用，标记为GC-2；三、大孔吸附树脂柱层析法分离甘草抗肿瘤有效部位GC-3：取GC-2加入到预处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱顶端，加入量为2％柱体积，8mg/次，共6次，待渗入树脂层，依次用蒸馏水、体积浓度为30％的乙醇溶液、体积浓度为60％的乙醇溶液、体积浓度为90％的乙醇溶液，以5.00ml/min流速进行洗脱，收集洗脱部分，体积浓度为90％的乙醇洗脱液经100℃条件下减压浓缩后标记为GC-3；四、制备薄层层析法分离甘草抗肿瘤活性物质GC-4：GC-3经点样后在通风橱中用展开剂在薄层制备板上展开，经显色划线、收集滤液后冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用，标记为GC-4；五、制备薄层层析法分离甘草抗肿瘤活性物质GC-5：GC-4经点样后在通风橱中用展开剂在薄层制备板上展开，经显色划线、收集滤液后冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用，标记为GC-5，即完成甘草中抗肿瘤活性物质的提取，GC-5经高效液相色谱-质谱联用鉴别，它由甘草香豆酮、甘草吡喃香豆素和甘草异黄酮组成。甘草中抗肿瘤活性物质的应用，它用于体外诱导人宫颈癌Hela细胞和人胃癌SGC-7901细胞凋亡。本专利技术以我国资源丰富，价格便宜，毒副作用低且易于普及的中草药甘草为研究对象，以抗肿瘤作用为导向，采用多种分离方法，对甘草进行分离、提取，得到甘草抗肿瘤活性物质GC-5，并且对该物质进行了系统的抗肿瘤活性的测定，证明该物质具有体外诱导人胃癌SGC-7901细胞和人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用，并且有效作用剂量低、抗肿瘤作用明显。本专利技术甘草抗肿瘤活性物质GC-5对人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC-7901细胞的增殖均具有很强的抑制作用，并存在剂量时间依赖性，其IC50均较低。GC-5作用Hela细胞48h的IC50仅为11.24μg/ml，作用于人胃癌SGC-7901细胞36h的IC50为23.21μg/ml。根据《国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编》规定，植物粗提物的IC50＜20μg/m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞具有杀伤作用，由此可判定GC-5是一种很强的抗肿瘤活性物质。经过鉴别，发现GC-5不是常见的甘草酸或甘草次酸，而表现为3种化学单体成分，即甘草香豆酮、甘草吡喃香豆素、甘草异黄酮，其都属甘草黄酮类物质。本专利技术既对从甘草中开发出高效、低毒的抗肿瘤活性物质提供了理论依据，也为进一步研究三种单体成分的生物活性提供了实验基础。附图说明图1为实施例中不同浓度GC-5对Hela细胞增殖抑制作用的曲线图，其中▲表示48h，■表示24h，◆表示12h；图2为实施例中不同浓度GC-5对SGC-7901细胞增殖抑制作用的曲线图，其中*表示36h，▲表示24h，■表示12h，◆表示6h；图3为实施例中对照组，AO/EB双荧光染色法检测24h的HeLa细胞的形态学变化图(×40)；图4为实施例中25μg/mlGC-5，AO/EB双荧光染色法检测24h的HeLa细胞的形态学变化图(×40)；图5为实施例中50μg/mlGC-5，AO/EB双荧光染色法检测24h的HeLa细胞的形态学变化图(×40)；图6为实施例中20μg/ml顺铂，AO/EB双荧光染色法检测24h的HeLa细胞的形态学变化图(×40)；图7为实施例中对照组，AO/EB双荧光染色法检测12h的SGC-7901细胞的形态学变化图(×40)；图8为实施例中25μg/mlGC-5，AO/EB双荧光染色法检测药物作用12h后SGC-7901细胞凋亡的形态学变化图(×40)；图9为实施例中0μg/mlGC-5，AO/EB双荧光染色法检测12h的SGC-7901细胞的形态学变化图(×40)；图10为实施例中20μg/ml顺铂，AO/EB双荧光染色法检测12h的SGC-7901细胞的形态学变化图(×40)；图11为实施例中透射电镜下正常Hela细胞24h的形态图(正常细胞×4000)；图12为实施例中透射电镜下Hela细胞24h的形态图(正常细胞×12000)；图13为实施例中25μg/mlGC-5作用24h透射电镜下Hela细胞形态图(实验组细胞×4000)；图14为实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
甘草中抗肿瘤活性物质，其特征在于它按质量份数由0.5～1份的甘草香豆酮、0.5～1份的甘草吡喃香豆素和0.5～1份的甘草异黄酮组成。

【技术特征摘要】
1.甘草中抗肿瘤活性物质，其特征在于它按质量份数由0.5～1份的甘草香豆酮、0.5～1份的甘草吡喃香豆素和0.5～1份的甘草异黄酮组成。2.根据权利要求1所述的甘草中抗肿瘤活性物质，其特征在于它按质量份数由0.8份的甘草香豆酮、0.8份的甘草吡喃香豆素和0.8份的甘草异黄酮组成。3.甘草中抗肿瘤活性物质的提取方法，其特征在于它按以下步骤进行的：一、甘草水提液GC-1的制备：取甘草1000g经过筛除尘后，用自来水清洗4～6遍，然后用蒸馏水清洗2～4遍，再加蒸馏水至液面高出甘草8～12cm，浸泡12h，次日于文火100℃煮沸，2h后趁热用脱脂棉过滤，药渣重复提取1次，然后用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，于100℃蒸发浓缩至1.00mg/ml，制成甘草水提液，经三日间歇平压灭菌法灭菌，每次40min，置4℃冰箱保存备用，标记为GC-1；二、乙醇沉淀法初步分离甘草抗肿瘤有效部位GC-2：取3.5ml的GC-1置于塑料离心管中，然后向其中分段加入无水乙醇，并不断震荡，直至乙醇体积达到90％为止，将离心管置4℃冰箱12h后，于低温离心机4℃，4000r/min离心15min，收集沉淀，加蒸馏水溶解沉淀，滤纸过滤，减压浓缩至1.00mg/ml，置于4℃冰箱保存备用，标记为GC-2；三、大孔吸附树脂柱层析法分离甘草抗肿瘤有效部位GC-3：取GC-2加入到预处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱顶端，加入量为2％柱体积，8mg/次，共6次，待渗入树脂层，依次用蒸馏水、体积浓度为30％的乙醇溶液、体积浓度为60％的乙醇溶液、体积浓度为90％的乙醇溶液，以5.00ml/min流速进行洗脱，收集洗脱部分，体积浓度为90％的乙醇洗脱液经100℃条件下减压浓缩后标记为GC-3；四、制备薄层层析法分离甘草抗肿瘤活性物质GC-4：GC-3经点样后在通风橱中用展开剂在薄层制备板上展开，经显色划线、收集滤液后冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用，标记为GC-4；五、制备薄层层析法分离甘草抗肿瘤活性物质GC-5：GC-4经点样后在通风橱中用展开剂在薄层制备板上展开，经显色划线、收集滤液后冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用，标记为GC-5，即完成甘草中抗肿瘤活性物质的提取，GC-5经高效液相色谱-质谱联用鉴别，它由甘草香豆酮、甘草吡喃香豆素和甘草异黄酮组成；其中步骤四中制备薄层层析法分离甘草抗肿瘤活性物质GC-4的具体步骤如下：a点样：先用针头在距薄层制备板一端1cm处划...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫，李洪源，薛英威，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23