一种能共传输药物和基因的纳米囊泡、制造方法及其应用，该纳米囊泡的成分为聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸（二异丙基乙二胺/半胱胺酸），其制备方法是先用正丁胺引发天冬氨酸苄酯-N-羧基内酸酐开环聚合得聚天冬氨酸苄酯，将末端氨基羧基化后再经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解得到末端羧基化的聚天冬氨酸（二异丙基乙二胺/半胱胺酸），最后通过酰胺化反应得到聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸（二异丙基乙二胺/半胱胺酸）。本发明专利技术的纳米囊泡可作为亲水性药物与基因的共输送载体，囊泡的疏水层具有酸敏响应性，同时用于囊泡疏水层捆绑交联的二硫键兼具还原敏感性，纳米囊泡外层的聚乙烯亚胺层具有质子缓冲效应，因此有智能释放基因和药物的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种能共传输药物和基因的纳米囊泡、制造方法及其应用
本专利技术属于高分子化学和生物医学工程领域，具体是涉及一种可作为传输新型药物和基因的双载体材料的纳米囊泡和其制造方法及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁着人类的生存健康，对于癌症的治疗是目前最具有挑战性的课题之一。目前临床上多采用外科手术进行治疗，但这通常适用于肿瘤还没有开始向全身扩散的情况。放疗和化疗的应用显著提高了恶性肿瘤的治疗效果。其中化疗对于各种血液恶性肿瘤、胚细胞瘤等具有相当大的治疗潜力，但是化疗药物对正常组织和器官的毒副作用是困扰肿瘤化疗的主要问题。此外，随着分子生物学的发展，尤其是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明，癌症的基因疗法也应运而生。目前多采用裸DNA注射法，即将质粒DNA或RNA直接注入靶组织的方法，但由于体内核酸酶等对DNA的降解作用，基因表达的时间很短，严重影响治疗效果。研究表明，将基因治疗与药物治疗这两种手段结合起来，可以起到相互促进、相互结合的效果。例如，目前新兴的“自杀”基因疗法，即将无毒的抗肿瘤前药与相应的“自杀”基因结合起来，待基因成功转染进入肿瘤细胞后，表达的酶可以将抗肿瘤前药转化为高毒性的化疗药物，从而实现对肿瘤细胞的选择性杀伤，避免了对正常细胞的损害。要解决目前临床上化疗及基因治疗面临的问题并实现药物与基因协同治疗，关键在于构建行之有效的药物/基因共输送载体。该载体要能够将质粒DNA安全输送到肿瘤细胞的胞浆中，避免体内核酸酶的降解；同时将化疗药物或前药安全有效地递送至肿瘤部位使其发挥作用。肿瘤组织与正常组织存在生理性差异，如肿瘤血管内皮细胞间隙大及肿瘤部位淋巴循环受限，导致纳米粒子在肿瘤部位的增强渗透存在滞留(Enhanced permeability andretention)效应(EPR效应)。因此,纳米药物载体可以通过EPR效应被动祀向富集于肿瘤部位。此外，纳米药物载体还具有很多传统药物载体不具备的其他优点:能形成纳米颗粒包裹、浓缩、保护基因/药物，使其免遭生物酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面进行修饰，偶联靶向分子，实现对肿瘤的主动靶向识别；在循环系统中的循环时间明显延长且不易被巨噬细胞清除；能够实现药物/基因的控制释放，提高基因/药物的生物利用度；代谢产物少、副作用小，无免疫排斥反应等。因此，多功能纳米药物载体的研发，被认为是解决目前化疗和基因治疗面临问题的有效途径，也是目前癌症治疗方面的一个重要研究领域。纳米载体的理化性能，如表面修饰、粒径和形貌、化学组成、表面电位等参数是影响纳米粒子的EPR效应(被动靶向性能)和主动靶向性能的关键因素，而聚合物纳米药物载体可以实现对以上参数的有效调控因此受到研究者的亲睐。目前，单独递送药物或基因的纳米载体方面的研究较多，而同时输送药物/基因的纳米载体还鲜见报道。药物载体目前面临的最大问题是血液循环时结构不稳定及到达肿瘤部位后释药缓慢，前者影响纳米粒子在肿瘤部位的有效富集并造成药物丢失，进而削弱抑瘤效果且增加毒副作用；后者降低了药物的生物利用度并可能诱导肿瘤细胞产生多药耐药，影响后期治疗。一方面，可以采用还原敏感的二硫键对纳米载体进行交联捆绑，这是提高纳米粒子血液稳定性的有效手段，且二硫键在肿瘤细胞溶酶体内高的谷胱甘肽浓度下会快速断裂，有助于纳米粒子在肿瘤细胞内解体；另一方面，可以采用具有刺激响应功能的聚合物构建纳米载体，赋予纳米载体在肿瘤内环境的刺激响应下快速释药。目前，研究者多采用阳离子聚合物传输基因，阳离子聚合物链通过静电作用与基因的磷酸盐骨架复合后形成纳米粒子，然而这样形成的纳米粒子的粒径难以控制，粒径分散宽，且容易聚集沉淀，不利于体内应用。而将聚合物组装成纳米胶束或囊泡后再进行基因的负载就可以有效地解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述存在问题和不足，提供一种可作为传输药物和基因的双载体材料，能实现基因的有效转染及瘤内暴释药物，且二硫键交联捆绑稳定的酸敏响应型的纳米囊泡及其制造方法。在上述基础上，本专利技术进一步的目的是提供一种纳米囊泡作为药物和基因双载体材料中的应用。本专利技术的技术方案是这样实现的: 本专利技术所述的能共传输药物和基因的纳米囊泡，其特点是该纳米囊泡为由表层的聚乙烯亚胺和中间层的聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)构成且中间层带有可交联巯基的聚乙烯亚胺_b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡，该纳米囊泡的中间层为疏水层，该疏水层具有酸敏响应性，能发生PH值敏感的亲-疏水性的转换；同时，用于中间层交联捆绑的巯基(二硫键)具有还原敏感性；此外，该纳米囊泡外层的聚乙烯亚胺层具有质子缓冲效应，能用于基因的传输，实现基因的溶酶体逃逸。其中，上述聚乙烯亚胺为支化型，其数均分子量为600 Da，上述聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)的数均分子量为I~10 KDa0本专利技术所述的能共传输药物和基因的纳米囊泡的制造方法，其特点是包括如下步骤: A、用正丁胺为引发剂，引发β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐聚合反应，反应结束后，将反应液沉淀、抽滤和洗涤后，真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸苄酯； B、采用马来酸酐对聚天冬氨酸苄酯末端的氨基进行羧基化反应，并将反应得到的产物冷冻干燥后，得到白色粉末状的羧基化聚天冬氨酸苄酯； C、将羧基化聚天冬氨酸苄酯经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反应后，将反应物透析、旋干，得到羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸); D、在催化剂的催化下，将羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)进行酰胺化反应，并将反应液透析、浓缩和抽干后，得到聚合物聚乙烯亚胺-b_聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸); E、将聚乙烯亚胺 -b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有机溶剂中，并在超声作用下将溶液滴至PH值为9的缓冲溶液中，通氧气2 h后，在pH值为7.4的缓冲溶液中透析三天，得到含有聚乙烯亚胺_b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡的溶液。其中，上述催化剂为1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDOHCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其中，上述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或二甲基酰胺(DMF)或甲醇。本专利技术所述的纳米囊泡在传输药物和基因中的应用，其特点是应用方法如下: 首先将聚乙烯亚胺_b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡作为载体与亲水性抗肿瘤前药按一定的比例混合共同形成为原料，然后将原料溶于有机溶剂中配制成溶液，在超声作用下将制得的溶液滴加至PH值为9的缓冲溶液中，通氧气，再经过透析除去未包裹的药物及有机溶剂，最后将溶液的PH值调至7.4，即得到载药纳米囊泡；将载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的一定摩尔比(即N/P比)混合均匀后振荡15秒，于室温静置后得到载药-基因纳米囊泡。其中，上述聚乙烯亚胺_b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡可用于癌症自杀基因疗法如5-氟胞嘧啶(5-FC)和胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的输送。在自组装过程中，PAsp (DIP/MEA)段自发地形成囊泡的疏水中间层，在通氧条件下囊泡被二硫键交联捆绑稳定，⑶基因被压缩包裹于囊泡外表面的PEI层，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能共传输药物和基因的纳米囊泡，其特征在于该纳米囊泡为由表层的聚乙烯亚胺和中间层的聚天冬氨酸（二异丙基乙二胺/半胱胺酸）构成且中间层带有可交联巯基的聚乙烯亚胺‑b‑聚天冬氨酸（二异丙基乙二胺/半胱胺酸）纳米囊泡。
【技术特征摘要】
1.一种能共传输药物和基因的纳米囊泡，其特征在于该纳米囊泡为由表层的聚乙烯亚胺和中间层的聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)构成且中间层带有可交联巯基的聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡。2.根据权利要求1所述能共传输药物和基因的纳米囊泡，其特征在于上述聚乙烯亚胺为支化型，其数均分子量为600 Da,上述聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)的数均分子量为I~10 KDa03.一种能共传输药物和基因的纳米囊泡的制造方法，该方法用于制造如前述任一权利要求所述的纳米囊泡，其特征在于包括如下步骤: A、用正丁胺为引发剂，引发β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐聚合反应，反应结束后，将反应液沉淀、抽滤和洗涤后，真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸苄酯； B、采用马来酸酐对聚天冬氨酸苄酯末端的氨基进行羧基化反应，并将反应得到的产物冷冻干燥后，得到白色粉末状的羧基化聚天冬氨酸苄酯； C、将羧基化聚天冬氨酸苄酯经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反应后，将反应物透析、旋干，得到羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸); D、在催化剂的催化下，将羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)与聚乙烯亚胺进行酰胺化反应，并将反应液透析、浓缩和抽干后，得到聚合物聚乙烯亚胺-b_聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸); E、将聚乙烯亚胺- b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有机溶剂中，并在超声作用下将溶液滴至PH值为9的缓冲溶液中，通氧气2 h后，在pH值为7.4的缓冲溶液中透析三天，得到含有聚乙烯亚胺_b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡的溶液。4.根据权利要求1或2所述纳米囊泡于传输药物和...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋庆，王露，苑园园，曹众，帅心涛，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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