本发明专利技术涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白。在具体的实例中，这些受体基因启动子调节内皮素受体A、内皮素受体B、Toll样受体4或高亲和力IgE受体的表达。指向内皮素A或B受体的人工转录因子用于治疗由内皮素调节的疾病，诸如心血管疾病和尤其是眼疾病，例如视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、黄斑水肿、视神经病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视网膜色素变性、Leber遗传性视神经病变等。指向Toll样受体4或IgE受体的人工转录因子分别用于治疗自身免疫病症等，和变应性病症。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过递送人工转录因子调节受体表达专利
本专利技术涉及人工转录因子，其包含融合至抑制或激活结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白，以及它们在治疗由特异性效应物与此类受体的结合所调节的疾病中的用途。
技术介绍
提出人工转录因子(ATF)是用于调苄基因表达的有用工具(Sera T.，2009, AdvDrug Deliv Rev &1, 513-526)。许多天然存在的转录因子通过抑制或激活基因转录来影响表达，具有识别某一 DNA序列的复杂的特定结构域。如果技术人员意在修饰它们的特异性和一个或多个靶基因，则这使得它们对于操作而言是无吸引力的目标。然而，某一类转录因子含有几个所谓锌指(ZF)结构域，它们是模块化的，并因此使得它们可以进行遗传工程。锌指是几乎独立靶向三个DNA碱基对的短(30个氨基酸)DNA结合基序。含有几个此类锌指的蛋白因此能够识别更长的DNA序列。六聚锌指蛋白(ZFP )识别18个碱基对(bp )的DNA靶，其在整个人基因组中几乎是唯一的。最初认为是完全背景独立的，但更深入的分析显示对于锌指的某些背景特异性(KlugA.，2010, AnnuRevBiocheml^, 213-231)。突变在锌指识别表面中的某些氨基酸改变ZF模块的结合特异性产生对于大部分的5’-GNN-3’、5’-CNN-3’、5’ -ANN-3’和某些5’ -TNN-3’密码子的确定的ZF结构单元(例如所谓的Barbas模块，见Dreier B.，Barbas C.F.3rd 等，2005，JBiol Chem 280, 35588-35597)。尽管关于人工转录因子的早期工作集中于基于组合预先选择的锌指与已知的3 bp靶序列的合理设计，但意识到锌指的某一背景特异性需要产生大的锌指文库，其使用复杂方法诸如细菌或酵母单杂交、卩遼菌体展示、区室化核糖体展示(compartmentalized ribosome display)或使用FACS分析的体内选择来询问。使用此类人工锌指蛋白，可以以高特异性靶向在人基因组内的DNA基因座。因此，这些锌指蛋白是将具有转录调节活性的蛋白结构域转运至特定启动子序列以产生目标基因表达的调节的理想工具。用于转录沉默的合适结构域是Kru印pel相关的结构域(KRAB)如N-末端(SEQ ID NO:1)或C-末端(SEQ ID NO: 2) KRAB结构域、Sin3相互作用结构域(SID, SEQ ID NO: 3)和ERF阻抑蛋白结构域(ERD，SEQ ID NO: 4)，而基因转录的激活通过单纯疱疹病毒VP16 (SEQ ID NO: 5)或VP64 (VP16的四聚体重复，SEQ ID NO: 6)结构域来完成(Beerli R.R.等，Proc Natl Acad Sci USA 95，14628-14633)。此外，考虑通过基因本体论 G0:0001071 (http://amigo, geneontology.0rg/cg1-bin/amigo/term_details?term=G0:0001071)确定的蛋白的转录活性结构域实现革巴蛋白的转录调节。所有已知药物靶的很大百分比是受体分子，其被具有时常相当大的脱靶(off-target)活性的小分子药物的作用而刺激或阻断。此类受体的实例是组胺Hl受体或α和β肾上腺素受体，但通常是通过基因本体论G0:0004888和G0:0004930确定的蛋白。 尽管由于特定特征的高保守性，小分子药物并非总能选择性靶向给定蛋白家族的某一成员，但如基于抗体的新药物所显示出的，生物制剂提供了巨大的特异性。然而，实际上所有生物制剂到目前为止均在细胞外起作用。尤其是上文提及的人工转录因子将适合于以治疗上有用的方式影响基因转录。然而，此类因子向作用位点一细胞核一的递送并不容易实现，因而妨碍了治疗性人工转录因子方法的有效性，例如通过依赖于逆转录病毒递送具有该方法的所有缺点，诸如免疫原性和细胞转化的潜能(Lund C.V.等，2005，Mol Cell Biol 25，9082-9091)。所谓的蛋白质转导结构域(PTD)显示促进蛋白经质膜易位至细胞溶胶/核质中。短肽诸如HIV来源的TAT肽(SEQ ID NO: 7)和其他显示出诱导不依赖于细胞类型的货物蛋白质的大胞饮摄取(ffadia J.S.etal.，2004，NatMed 10，310-315)。当到达细胞溶胶中时，此类融合蛋白显示出具有生物活性。有趣的是，在蛋白转导后，极可能是通过胞内蛋白伴侣的作用，即使错误折叠的蛋白也能够变得有功能。血管活性内皮素系统在多种疾病的发病中起重要作用。内皮素一方面参与调节血液供给，并且另一方面是由低氧诱导的事件级联中的主要参与者。内皮素例如参与血脑或血视网膜屏障的破坏和参与新血管形成。此外，内皮素参与神经变性以及调节痛觉或甚至口渴感觉的阈值。内皮素还参与调节眼内压。内皮素作用通过它的同族受体来介导，主要是内皮素受体A，其通常位于环绕血管的平滑肌细胞上。影响内皮素系统一全身地或局部地一是治疗许多疾病诸如蛛网膜下腔或脑出血所关注的。内皮素还影响多发性硬化的病程。内皮素是(肺动脉)高血压的原因，而且也是低动脉压、心肌病和雷诺综合征、变异型心绞痛和其他心血管疾病的原因。内皮素参与糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病变。在眼中，它还对青光眼性神经变性、视网膜静脉阻塞、巨细胞性关节炎、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、Morbus Leber、Susac综合征、眼内出血、视网膜前神经胶质增生和某些其他病理学病况起作用。眼是精密器官，其强烈依赖于平衡的且充足的灌注以达到它的高需氧量。无法提供充足且稳定的供氧会引起局部缺血-再灌注损伤，导致神经胶质活化和神经元损害，如在患有渐进性疾病的青光眼患者中所观察到的，尽管其具有正常或标准化的眼内压。如在糖尿病性视网膜病变或湿性年龄相关性黄斑变性中显而易见的，不充足的血液供给还导致低氧，引起具有进一步视网膜损害潜能的失控的(run-away)新血管形成。眼组织灌注在复杂控制之下并且依赖于血压、眼内压以及调节血管直径的局部因子。此类局部因子例如提及的内皮素、具有强血管收缩活性的短肽。内皮素的三种同工型(ET-1、ET-2和ET-3)由内皮素转化酶从位于血管壁中的内皮细胞分泌的前体分子来产生。成熟ET的两个同族受体是已知的，ETRA和ETRB。尽管ETRA位于形成血管壁的平滑肌细胞中并促进血管收缩，但ETRB主要表达于内皮细胞中，并且通过促进一氧化氮的释放来使血管舒张，因而引起平滑肌松弛。ETRA和ETRB属于G蛋白偶联的七跨膜螺旋受体的大类。ET与ETRA或ETRB的结合导致G蛋白活化，因而引发胞内钙浓度的升高，并由此引起一大批的细胞反应。药理学上影响ET系统可能证明在其中ET水平升高并且ET以有害形式起作用的病例中，诸如在视网膜静脉阻塞、青光眼性神经变性、视网膜色素变性、巨细胞性关节炎、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、多发性硬化、视神经炎、类风湿性关节炎、Susac综合征、辐射性视网膜病变、视网膜前神经胶质增生、纤维肌痛和糖尿病性视网膜病变过程中是有用的。为此目的，下本文档来自技高网...
【技术保护点】
人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.11 EP 11184706.71.人工转录因子，其包含融合至抑制或激活蛋白结构域、核定位序列和蛋白质转导结构域的特异性靶向受体基因启动子的多指锌指蛋白。2.人工转录因子，其中受体基因启动子是内皮素受体A启动子。3.人工转录因子，其中受体基因启动子是内皮素受体B启动子。4.人工转录因子，其中受体基因启动子是Toll样受体4启动子。5.人工转录因子，其中受体基因启动子是FCERlA启动子。6.权利要求1、2、3、4或5的人工转录因子，其包含六聚锌指蛋白。7.权利要求2、3、4或5的人工转录因子，其包含具有选自以下的蛋白序列的锌指蛋白:SEQ ID NO: 31 至 SEQ ID NO: 37,SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 45 至 SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:52,SEQ IDN0:54 至 SEQ ID NO:57,SEQ IDN0:59 至 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66 MSEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82 至 SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97 至 SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120至 SEQ ID NO: 136,SEQ ID NO: 138 至 SEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 145 至 SEQ ID NO: 153,SEQ IDNO: 155 至 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO: 166 至 SEQ ID NO: 173,SEQ ID NO: 175 至 SEQ ID NO: 181、和 SEQ ID NO: 183 至 SEQ ID NO: 191。8.权利要求 2、3、4或5的人工转录因子，其包含具有选自以下蛋白序列的锌指蛋白:SEQ ID NO 56、83、85、101、114、118、127、133、140、142、146、147、156、159、175、和 181。9.权利要求2、3、4或5的人工转录因子，其包含SEQID NO 118、133、156、或175的锌指蛋白。10.权利要求1-9中任一项的人工转录因子，其中所述锌指蛋白融合至抑制蛋白结合域。11.权利要求10的人工转录因子，其中所述抑制蛋白结构域是SEQID NO:1的N-末端KRAB, SEQ ID NO: 2 的 C-末端的 KRAB、SEQ ID NO: 3 的 SID、或 SEQ ID NO: 4 的 ERD。12.权利要求1-9中任一项的人工转录因子，其中所述锌指蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：J弗拉梅，A纽茨纳，A赫克斯利，
申请(专利权)人：阿里奥弗塔股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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