本发明专利技术公开了一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术和动物传染病诊断研究领域。该ELISA试剂盒包含有：包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原（猪瘟病毒Erns蛋白）、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液。本发明专利技术采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的猪瘟病毒Erns IgM抗体，所制成的试剂盒特异性达100%，灵敏度1:800，可用于对猪瘟病毒感染的诊断及猪瘟疫苗的免疫效果评价。
【技术实现步骤摘要】
—种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒
本专利技术属于生物技术和动物传染病诊断研究领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒。
技术介绍
猪痕是由猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病，对养猪业危害严重，是世界粮农组织和各国政府严密监控和检疫的主要传染病之一 OCSFV属黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、Erns (EO)、EUE2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除 C、Erns、El 和 E2 为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。猪感染CSFV后主要产生针对结构糖蛋白E0、E2和非结构蛋白NS3的抗体。糖蛋白EO和E2是病毒诱导机体产生中和抗体的两个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白。Erns是病毒的一种囊膜糖蛋白，也称gp44/48,旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu268_Ala494组成。在感染细胞中Erns在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱，易从囊膜上游离下来。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码Erns的核酸序列在属内比编码E2的序列保守程度高，因此Erns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。猪瘟病毒的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前猪瘟病毒检测方法主要有应用病毒分离鉴定、免疫组织化学法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Elisa检测等。其中Elisa检测法以其快速、方便、敏感等优点，在众多方法中脱颖而出。但市场中的Elisa试剂盒多为检测抗E2抗体的试剂盒，而无对Erns IgM抗体的方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种检测猪瘟病毒(CSFV) Erns IgM抗体的ELISA试剂盒。本专利技术的目的还在于提供上述检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的以下技术方案:一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，包含有:包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液。所述的检测用抗原为重组猪瘟病毒Erns(CSFV-Erns)蛋白，以样品稀释液溶解稀释至5-10 μ g/mL ;优选的，所述的重组猪瘟病毒Erns蛋白通过包含如下步骤的方法制备得到:提取猪瘟病毒的RNA为模板通过反转录PCR扩增Erns蛋白目的基因，将目的基因与连接到pET30a载体上再转入含有PGr07重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21 (DE3)进行原核表达、纯化得到纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白；其中扩增引物为:CSFV-Erns 基因上游引物:5 ’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3 ’，CSFV-Erns 基因下游引物:5 ’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3 ’。所述的包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板，所包被的抗猪IgM单克隆抗体的量优选为0.1-0.5 μ g。所述的抗猪IgM单克隆抗体可商购，或按照包含如下步骤的方法制备:以纯化的猪IgM免疫Balb/c小鼠，取免疫成功的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经克隆与ELISA筛选，最终分别筛选出可识别猪IgM的杂交瘤细胞株，以此杂交瘤细胞株注射至小鼠腹腔生产腹水并用辛酸硫酸铵沉淀法纯化腹水得到抗猪IgM单克隆抗体。包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板优选通过包含如下步骤的方法得到:通过将抗猪IgM单克隆抗体用包被缓冲液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释成1_5 μ g/mL，往酶标板上每孔加入100yL，4°C包被过夜;每孔再加入150 μ L封闭液(5_BSA，以0.01mol/L,ρΗ7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制)，37°C温育Ih0所述的样品稀释液优选为含1% BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠(NaN3)的PBS，其中所述的PBS优选为0.01mol/L, pH值为7.2-7.4的PBS0所述的阳性对照为用样品稀释液100倍稀释的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的的猪阳性血清，此血清为以猪瘟兔化弱毒苗免疫获得；所述的阴性对照为用样品稀释液100倍稀释的未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪阴性血清。所述的浓缩洗涤液(IOX)优选为含0.5% Tween20的0.lmol/L、ρΗ7.2-7.4的PBS，使用前用去离子水做10倍稀释。所述的酶结合物优选为辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，其工作浓度为10-20 μ g/mL，优选通过包含如下步骤的方法制备:I)制备抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体:用纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白免疫Balb/c小鼠，三免后，取Elisa效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基选择性培养后，进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔进行亚克隆；再取亚克隆孔进行间接Elisa检测，挑选出阳性孔转入24孔板进行第二次亚克隆；对二亚细胞株进行间接Elisa检测及免疫荧光筛选出抗猪瘟病毒Erns蛋白的单克隆杂交瘤细胞株；将此杂交瘤细胞株进行冻存，同时打3只小鼠制备腹水，将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵沉淀法纯化、透析，制得抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体。2)将抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，其步骤是:称取5mgHRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混匀置冰箱4度反应30分钟，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室温避光反应30分钟后加入含5mg抗猪痕病毒Erns单克隆抗体的水溶液ImL,混勻并装透析袋与0.05mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，使之结合；然后吸出加入NaBH4溶液(5mg/mL) 0.2mL,置冰箱4度2h，取出加入等体积饱和硫酸铵；放冰箱4度30min后离心，将所得沉淀物溶于少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，并透析过夜；次日再离心除去不溶物，即得HRP标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体；用0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL，再以Bradford法测定浓度，然后以酶标抗体稀释液(可商购)稀释至10-20 μ g/mL制成酶结合物工作液。所述的酶显色底物优选为TMB显色液。所述的终止液优选为lmol/L的H2SO4溶液。上述检测猪瘟病毒(CSFV)Erns Ig本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包含有：包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液；所述的检测用抗原为猪瘟病毒Erns蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包含有:包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液；所述的检测用抗原为猪瘟病毒Erns蛋白。2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的检测用抗原的浓度为5-10μ g/mL ;所述的猪瘟病毒Erns蛋白通过包含如下步骤的方法制备得到:提取猪瘟病毒的RNA为模板通过反转录PCR扩增Erns蛋白目的基因，将目的基因与连接到pET30a载体上再转入含有PGr07重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21进行原核表达、纯化得到纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白；其中扩增引物为: CSFV-Erns 基因上游引物:5’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’， CSFV-Erns 基因下游引物:5’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’。3.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的抗猪IgM单克隆抗体的量为0.1-0.5 μ go4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的样品稀释液为含1% BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠的PBS。5.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照为用样品稀释液100倍稀释的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的的猪阳性血清；所述的阴性对 照为用样品稀释液100倍稀释的未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪阴性血清。6.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒ErnsIgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述的浓缩洗涤液为含0.5% ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李建，漆世华，韩兴，舒银辉，廖园园，刘洁，谢红玲，秦红刚，徐松，牟林琳，朱薇，温文生，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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