本发明专利技术属地层水微生物研究领域，为解决现有对环境中微生物多样性的研究存在较大局限性，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分微生物种类等问题，提供一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法。包括煤层水样采集，富集水样中的微生物菌体及提取其总DNA，用特异性引物扩增16SrDNA高变区，通过Illumina测序平台进行测序分析，对测序的原始数据处理后，获得水样中微生物的多样性及丰度。本发明专利技术有效检测出样品中丰度低的物种，在煤层水中鉴定的菌种在属水平上多于400个属，在研究煤层水中的微生物种类及丰度中有明显的优越性。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物多样性和物种丰度分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于地层水微生物研究领域，具体为。
技术介绍
煤层气(Coalbed gas)，俗称瓦斯，是成煤过程中生成、并以吸附和游离状态赋存于煤层及周岩的自储式天然气体，其中CH4的体积分数最高在95%以上。据2006年国家油气资源评价，我国埋深小于2000m的煤层气资源量达到36.81 X 1012 m3，与我国天然气的远景资源量基本相当。随着国民经济的快速增长，我国对能源的需求日益增多。煤层气作为非常规天然气，是我国天然气资源的重要补充来源。开发和利用煤层气资源，可减少或避免煤矿瓦斯灾害的发生，大幅度降低温室气体的排放，保护生态环境，具有重要的现实意义。 煤层气一般分为生物成因煤层气和热成因煤层气两类。生物成因煤层气是指在微生物作用下，煤中部分有机质转化为以甲烷为主要成分的气体。因此，研究煤层或煤层水中的微生物及其多样性，分析参与煤降解和成气过程中的微生物种类，有助于揭示生物成因煤层气的生成机理，也为煤层气的二次开发利用提供了理论依据。传统上研究环境中微生物多样性的方法有很多，一般先对微生物进行培养，再通过分子生物学方法，如:末端限制性内切酶片段长度多样性(T-RFLP)、荧光原位杂交(FISH)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)等分析微生物群体的种类。这些技术共有的缺点是在进行检测时，需要样品的量较大，操作繁琐，费时费力，灵敏度低，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分的微生物种类。因此，在研究样品中微生物的多样性方面有很大的局限。而宏基因组学，是以特定生境中的整个微生物群落作为研究的对象，不需对微生物进行分离培养，采用新一代高通量测序技术直接对环境微生物总DNA进行研究，测序数据能很好的满足分析微生物群体物种多样性和物种丰度等要求。申请号为201110005095.2的专利《一种煤层气田地下水微生物检测方法》通过样品采集、DNA提取、16S rDNA文库构建以及DGGE分析，从而对地下水微生物群落结构做出分析。该专利并未提供出具体的实施步骤，通过该种方法，检测出古菌只有产甲烷古菌，且仅有甲烷八叠球菌属和甲烷叶菌属两个属的产甲烷菌；细菌主要为硬壁菌门，变形杆菌门和拟杆菌门。仅揭示出样品中很少一部分的微生物种类。对于样品中丰度较低的物种并没有有效的检测出来。因而导致该分析存在较大的误差，不能全面、精准的揭示生物成因煤层气的生成机理，也不能有效的为煤层气的二次开发利用提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有对环境中微生物多样性的研究存在较大局限性，需要样品的量较大，操作繁琐，费时费力，灵敏度低，对样品中丰度较低的物种不能有效检测出，难区分样品中相似度较高的物种，仅能揭示样品中很少一部分的微生物种类等问题，提供了。与传统方法相比，本专利技术能更准确的分析出煤层水中微生物的多样性和物种丰度。本专利技术由如下技术方案实现的:，步骤如下: (1)煤层水样采集:厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，_20°C密闭保存； (2)微生物菌体的富集和DNA提取:无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22Mm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGA0水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA ； (3)用特异性引物扩增16SrDNA V4高变区:设计16S rDNA V4高变区的特异性引物，扩增该高变区DNA片段； (4)Illumina平台测序分析:用带有Illumina通用接头序列的引物对扩增的高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列； (5)原始测序数据处理:使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列；根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS等拼接软 件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列； (6)完成物种分类:通过16SrDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。与现有技术相比:本专利技术不需要较大量的样品，操作简单，灵敏度高，可以有效的检测出样品中丰度低的物种，应用本专利技术所述方法在煤层水中鉴定出的菌种种类在属水平上多于400属，而传统方法如DGGE等在分析微生物多样性时,一般仅能分析出几十种微生物，在研究煤层水中的微生物种类及丰度中，具有明显的优越性。煤层气作为一种清洁能源，利用其补充常规天然气资源的不足已成为共识。生物成因作为煤层气形成的一部分缘由，具有可持续开发利用的特点，也是国内外能源领域研究的热点问题。研究生物因素导致煤层气形成的机理，需要对煤层中微生物有足够的认识，尽可能全面分析相关的微生物种类及丰度，以便于进一步分析这些微生物的生理特性及代谢特征，为明确煤层气形成的生物成因的机理提供理论依据。本专利技术所介绍的分析方法，能较全面的分析煤层水中微生物的种类及丰度。【附图说明】图1为本专利技术实施例煤层水中微生物多样性分析流程图；图2为本专利技术实施例中煤层水微生物总DNA电泳检测图；图3为本专利技术实施例中读序列在属水平上的分布饼图。【具体实施方式】以下将结合具体实施实例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1:，具体步骤如下: (1)煤层水样采集:厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体的体积大于装置体积5-10倍，置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，_20°C密闭保存； (2)微生物菌体的富集和DNA提取:为保证提取足量DNA，无菌操作台上将采集的3L水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22Mffl的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；将滤膜剪成宽度Imm的条状，并按重量比为6:3:1的量分为1、2、3三个样品；按照OMEGA0水样DNA提取试剂盒的说明，提取三个样品中微生物的总DNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，检测结果如图2所示，所提取的三个样品中I和2的DNA浓度较高，满足实验要求，其中 M 为 λ -Η?η? III DNA Marker ； (3)用V4区特异性引物扩增16SrDNA V4高变区:设计16S rDNA V4高变区的通用引物，F:5' -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' ,R:5/ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，用 TaKaRa 公司的Ex TaqO扩增该高变区DNA片段； (4)Illumina平台测序分析:用对高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列，即测序后获得的DNA序列片段。(5)原始测序数据处理:使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列。根据序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，其特征在于：步骤如下：（1）煤层水样采集：厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，‑20oC密闭保存；（2）微生物菌体的富集和DNA提取：无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22µm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGAÒ水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA；（3）用特异性引物扩增16S rDNA V4高变区：设计16S rDNA V4高变区的特异性引物，扩增该高变区DNA片段；（4）Illumina平台测序分析：用带有Illumina通用接头序列的引物对扩增的高变区DNA片段进行扩增，构建DNA文库，用Illumina测序仪对样品进行双末端测序，获得读序列;（5）原始测序数据处理：使用Mothur软件过滤原始读序列，去除接头污染的序列、去除低复杂度序列及含N的碱基数的序列，得到净序列；根据序列的重叠关系，利用Velvet或AbySS拼接软件将净序列拼接成标签序列，即全长的V4区序列；（6）完成物种分类：通过16S rDNA V4高变区数据库比对，将非冗余的标签序列进行物种注释并聚类成操作分类单位，完成物种多样性和物种丰度分析。...
【技术特征摘要】
1.一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法，其特征在于:步骤如下: (1)煤层水样采集:厌氧条件下采集煤层水样，用于存放水样的装置灭菌后置于超净工作台上，将氮气瓶或氩气瓶上连接的导管另一端连接过滤器后置于装置中，打开气瓶阀门，通入气体完全置换其中的空气；然后加入终浓度为0.05%的半胱氨酸作还原剂，-20°c密闭保存； (2)微生物菌体的富集和DNA提取:无菌操作台上将采集的水样通过真空抽滤装置过滤，用0.22Mm的细菌微孔滤膜收集过滤后的菌体和其它固体物质；用OMEGA0水样DNA提取试剂盒提取滤膜上的微生物总DNA ； (3)用特异性引物扩增16SrDNA V4高变区:设计16S rDNA V...
【专利技术属性】
技术研发人员：王保玉，刘建民，白建平，韩作颖，刘健，苗彪，赵娜，
申请(专利权)人：山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：山西;14
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