一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。上述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。本发明专利技术的葡萄糖氧化酶突变体的最适作用pH值为6.0，在pH4.0-6.0范围内均很稳定，pH耐受性与野生型差别不大；突变体的最适作用温度为40℃，且在60℃、65℃和70℃条件下分别处理1h后，仍能保持78.1％、47.7％和15.9％的残余酶活，耐热性远远高于野生型，从而说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，这一特性使突变体GODP-2H比野生型更适合在工业生产中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用
本专利技术属于功能基因改造
，具体涉及一种新型的葡萄糖氧化酶突变体及其应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β -D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β -D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-批喃葡萄糖表现出 强烈的特异性，葡萄糖分子Cl上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-0-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因此目前普遍采用基因工程方法构建更优良的菌株生产葡萄糖氧化酶。Silvia等人将来源于青霉的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母X33中进行表达，3L发酵罐酶活为50U/mL ;母敬郁等人利用瑞氏木霉表达重组的黑曲霉葡萄糖氧化酶，通过基因重组和诱变筛选使瑞氏木霉突变株的葡萄糖氧化酶发酵酶活达25U/mL ；Zhaowei Gao等人在毕赤酵母中表达来源于点青霉的葡萄糖氧化酶，经密码子偏好性优化的基因在3L发酵罐中酶活达到615U/mL，410%高于未经优化的基因(148U/mL)。但目前构建得到的基因工程菌株对葡萄糖氧化酶的表达能力尚不能满足工业生产的要求，导致该酶的生产成本还是居高不下，制约了该酶的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型葡萄糖氧化酶突变体及其应用。本专利技术通过将来源于斜卧青霉(Penicillum decumbens)的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造,获得了耐热性提高的突变体蛋白，并通过将该突变体基因转化入毕赤酵母中，构建得到重组表达工程菌株。所述葡萄糖氧化酶产量高，PH稳定性和热稳定性好，有利于其在食品和饲料领域的广泛应用。 申请人:对斜卧青霉的葡萄糖氧化酶进行突变，经过大量的筛选，发现N172R，C525N这两个突变位点能引起葡萄糖氧化酶耐热性的改变，从而促成本专利技术。本专利技术一方面提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。上述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为 SEQ ID NO:4o本专利技术另一方面提供了一种表达载体，其包含上述编码氨基酸序列为SEQ IDNO:3的葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸。本专利技术提供了一种重组宿主细胞，其携带有表达编码序列为SEQ ID NO:3的葡萄糖氧化酶突变体基因的表达载体。上述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。本专利技术还提供了上述葡萄糖氧化酶在食品中的应用。本专利技术所述葡萄糖氧化酶突变体的最适作用pH值为6.0，在pH4.0-6.0范围内均很稳定，pH耐受性与野生型差别不大；突变体的最适作用温度为40°C，且在60°C、65°C和70°C条件下分别处理Ih后，仍能保持78.\%Λ?.7%和15.9%的残余酶活，耐热性远远高于野生型，从而说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，这一特性使突变体G0DP-2H比野生型更适 合在工业生产中的应用。本专利技术所述葡萄糖氧化酶G0DP-2H能显著增强面团的筋力，从而有效地改善面团的操作性能，面团不粘，有弹性；醒发后面团表面白而且光滑、细腻；烘烤后面包体积膨大，比容大，且皮质细致，无斑点，不起泡，气孔细密均匀，内部组织纹理结构好，白度高。所述葡萄糖氧化酶可广泛应用于面粉及其制品加工领域。【附图说明】图1:毕赤酵母G0DP-2H发酵上清液SDS-PAGE电泳检测图。图2:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP_2pH-相对酶活曲线图。图3:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP_2pH稳定性比较图。图4:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP-2作用温度-相对酶活曲线图。图5:葡萄糖氧化酶突变体G0DP-2H和野生型G0DP-2耐热性比较图。【具体实施方式】以下实施例是为了更好地说明阐述本
技术实现思路
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1葡萄糖氧化酶突变体基因的合成及扩增为了提高来源于斜卧青霉的葡萄糖氧化酶G0DP_2(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物G0DP-2-F、G0DP-2-R 如下:G0DP-2-F:GGCGAATTCTACTTGCCAGCACAGCAAATTGATGT (下划线为限制性内切酶EcoR I识别位点)G0DP-2-R:ATAGCGGCCGCTTAAGCAGACTTGGCGTAGTCATCC (下划线为限制性内切酶Not I识别位点)以G0DP-2野生型基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，回收PCR产物的经EcoR1、NotI酶切处理后与经同样酶切后的pET-2 Ia载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37 °C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入500 μ L含有0.01mM IPTG的LB+Amp培养基，370C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。分别取出10 μ L裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70°C处理5min后，两块96孔板都加入40 μ L底物，于30°C反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。不同的突变子高温处理后保持的活性不同。有些突变子葡萄糖氧化酶的耐热性与野生型相比没有明显变化，有的突变子耐热性降低，筛选出耐热性提高的突变子进行DNA测序，最终， 申请人:找到了能提高葡萄糖氧化酶耐热性的突变组合N172R和C543N。含N172R和C543N两点突变的葡萄糖氧化酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:4由上海捷瑞生物公司合成。将合成的葡萄糖氧化酶突变体基因命名为G0DP-2H，用引物G0DP_2_F、G0DP-2-R进行PCR扩增，引物两端引入EcoR1、NotI位点。PCR反应条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn。2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO:3o3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求2所述的葡萄糖氧化酶突变体。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：付娟，肖志壮，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37