一种基于受体的检测β-内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条及其制备方法技术

一种基于受体的检测β-内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫学检测技术领域。本发明专利技术试纸条包括PVC背衬，PVC背衬前端设置样品垫，样品垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫连接；结合微孔板上含有抗β-内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物的混合物；硝酸纤维素膜上依次包被有氨苄西林-BSA检测线和羊抗鼠IgG控制线。本发明专利技术适合进行现场检测的免疫层析色谱检测法，能实现至少十五种β-内酰胺类抗生素的多残留检测；检测快速，仅需要5-10min；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。

【技术实现步骤摘要】
—种基于受体的检测β-内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种基于受体的检测β -内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫学检测
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技术介绍
因为现有兽药种类繁多，就β内酰胺类抗生素也有很多种，仅是单残留检测远不能满足对兽药滥用而导致的药物残留的很好检测。运用抗原抗体反应能够实现对一小部分的β内酰胺类抗生素的检测，但仍难以满足多残留检测的需要。现有的能实现多残留检测的方法主要是仪器分析，其中包括高效液相色谱法、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)和TTC法等。但这些检测方法需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，且不能适应高通量、现场的快速检测。因此实现具有快速，便携优点的免疫检测方法的多残留检测具有现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于受体的能够同时检测十五种β_内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条及其制备方法，该方法是基于针对该类抗生素的受体的。本专利技术的技术方案，一种基于受体的检测内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条，包括PVC背衬，在PVC背衬前端设置样品垫，样品垫为德国Schleicher&Schuell公司的Glass24垫，样品垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫连接，吸水垫材料是吸水纸；硝酸纤维素膜上依次包被有氨苄西林-BSA检测线和羊抗鼠IgG控制线；与其配套使用的结合微孔板，结合微孔板上的微孔中含有抗β_内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物的混合物。所述基于受体的检测β -内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法，制备步骤为: (1)氨苄西林-BSA偶联物的制备:将氨苄西林(AMP)与碳二亚胺(EDC)以1: 3摩尔比溶于pH 5,0.0lmol/L 2_(N_吗啉代)乙磺酸(MES)溶液中，室温搅拌活化lh，按摩尔比AMP: BSA=50: I称取BSA溶解在0.01M、pH7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液中，将AMP的活化物逐滴滴入BSA溶液中，室温反应4h，用生理盐水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶联物； (2)制备胶体金颗粒:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒； (3)抗β-内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物的制备:取步骤(2)制备的4mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg/mL的抗β -内酰胺类抗生素受体0.4mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%,放置至少30min后，10000 rpm离心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬，得到稳定的抗β -内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物。(4)小鼠阴性血清-胶体金标记物的制备:将步骤(3)中的抗β -内酰胺类抗生素受体替换为阴性小鼠的纯化血清，重复步骤(3)，得到小鼠阴性血清-胶体金标记物。(5)制作配套使用的结合微孔板:将步骤(3)和步骤(4)得到的抗内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物按体积比1:1混合后，取10 μ L混合物包被在96微孔板上； (6)硝酸纤维素膜的处理:将氨苄西林-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜上，依次作为检测线和控制线，在37°C烘箱干燥； (7)试纸条的组装:将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条，即得到用于检测的免疫层析试纸条，4°C冷藏备用。所述基于受体的检测β -内酰胺类抗生素的免疫胶体金试纸条的应用，其特征在于可以检测至少15种β内酰胺类抗生素；分别为阿莫西林，氨苄西林、青霉素G、青霉素V、邻氯青霉素，双氯青霉素，萘夫西林、苯唑西林、头孢克洛，头孢替唑、头孢噻肟、头孢噻呋、头孢哌酮、头孢硫脒，头孢吡肟。本专利技术的有益效果:本专利技术提供一种便携、快速、适合进行现场检测的免疫层析色谱检测法(gold immunochromatography assay;GICA),能实现至少十五种β_内酰胺类抗生素的多残留检测。本专利技术检测快速，仅需要5-10min ;便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。【附图说明】图1组装完成的免疫层析试纸条结构。1、PVC背衬；2、样品垫，3、硝酸纤维素膜，4、吸水垫，5、检测线，6、控制线。图2该试纸条对氨苄西林等十五种β -内酰胺类抗生素的检测结果。【具体实施方式】实施例1 如图1所示，PVC背衬I 一端依次粘贴样品垫2、硝酸纤维素膜3，另一端粘附吸水垫4，硝酸纤维素膜3上包被了氨苄西林-BSA作为检测线5，和羊抗鼠IgG作为控制线6。配套使用的微孔板上包被了抗β-内酰胺类抗生素的簇特异性抗体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物。按以下步骤制备: (1)氨苄西林-BSA偶联物的制备:将氨苄西林与EDC以1: 3摩尔比溶于MES(0.0lmol/L、pH 5)，室温搅拌活化lh，之后将活化物逐滴加入溶解了 BSA的HEPES(0.01mol/L、pH 7)中，BSA和氨苄西林的摩尔比为1:50，反应4h，用生理盐水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶联物； (2)制备胶体金颗粒:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒； (3)抗β-内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物的制备:取步骤(2)制备的4mL胶体金调至pH 9.0，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg/mL的抗β-内酰胺类抗生素受体0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%，放置至少30min后，10000 rpm离心50min，并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬，得到稳定的抗β -内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物； (4)小鼠阴性血清-胶体金标记物的制备:将步骤(3)中的抗β_内酰胺类抗生素受体替换为阴性小鼠的纯化血清，重复步骤(3)，得到小鼠阴性血清-胶体金标记物； (5)制作配套使用的结合微孔板:将步骤(3)和步骤(4)得到的抗β_内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物按体积比1:1混合后，取IOyL混合物包被在96微孔板上； (6)硝酸纤维素膜的处理:将氨苄西林-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜上，依次作为检测线和控制线，在37°C烘箱干燥； (7)试纸条的组装:将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条。即得到用于检测的免疫层析试纸条，4°C冷藏备用。应用实施例1 将阴性的纯牛奶与0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液(A液)，用0.0lM PBS:DMF=I: I的混合溶液分别配制lmg/mL的阿莫西林，氨苄西林，青霉素G，青霉素V，邻氯青霉素，双氯青霉素，萘夫西林，苯唑西林，头孢克洛，头孢替唑，头孢噻肟，头孢噻呋，头孢哌酮，头孢硫脒，头孢吡肟，头孢氨苄，头孢羟氨苄，头孢拉定，头孢呋辛，头孢地嗪。用A液稀释得到浓度为Wg/mL的标准品溶液。检测时取50 μ L lPg/mL的上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于受体的检测β‑内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条，其特征在于：包括PVC背衬（1），在PVC背衬（1）前端设置样品垫（2），样品垫为德国Schleicher&Schuell公司的Glass24垫，样品垫（2）与硝酸纤维素膜（3）前端连接，硝酸纤维素膜（3）后端与吸水垫（4）连接，吸水垫材料是吸水纸；硝酸纤维素膜（3）上依次包被有氨苄西林‑BSA检测线（5）和羊抗鼠IgG控制线（6）；与其配套使用的结合微孔板，结合微孔板上的微孔中含有抗β‑内酰胺类抗生素受体‑胶体金标记物和小鼠阴性血清‑胶体金标记物的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于受体的检测β-内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条，其特征在于:包括PVC背衬(1)，在PVC背衬(I)前端设置样品垫(2),样品垫为德国Schleicher&Schuell公司的Glass24垫，样品垫(2)与硝酸纤维素膜(3)前端连接，硝酸纤维素膜(3)后端与吸水垫(4)连接，吸水垫材料是吸水纸；硝酸纤维素膜(3)上依次包被有氨苄西林-BSA检测线(5)和羊抗鼠IgG控制线(6);与其配套使用的结合微孔板，结合微孔板上的微孔中含有抗β_内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物和小鼠阴性血清-胶体金标记物的混合物。2.权利要求1所述基于受体的检测内酰胺类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于制备步骤为: (1)氨苄西林-BSA偶联物的制备:将氨苄西林与碳二亚胺EDC以1: 3摩尔比溶于0.0lmol/L、pH 5的2-(N-吗啉代)乙磺酸MES中，室温搅拌活化lh，之后将活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES中，牛血清蛋白BSA和氨苄西林的摩尔比为1: 50，室温反应4h，用生理盐水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶联物； (2)制备胶体金颗粒:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒； (3)抗β-内酰胺类抗生素受体-胶体金标记物的制备:取步骤(2)制备的4mL胶体金调至pH 9.0，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，胥传来，郭靖男，徐丽广，马伟，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，
申请(专利权)人：无锡杰圣杰康生物科技有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32