修饰植物基因组的方法和手段技术

本发明专利技术提供了使用双链DNA断裂诱导酶以靶向方式紧靠现有原种事件修饰植物的基因组的方法和手段。还提供了植物，特别是棉花植物和制备此类植物的方法，所述植物对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂显示出耐受性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了使用双链DNA断裂诱导酶以靶向方式紧靠现有原种事件修饰植物的基因组的方法和手段。还提供了植物，特别是棉花植物和制备此类植物的方法，所述植物对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂显示出耐受性。【专利说明】修饰植物基因组的方法和手段本申请是申请日为2012年8月14日、专利技术名称为“修饰植物基因组的方法和手段”的中国专利申请201280049574.7 (国际申请号PCT/EP2012/065867)的分案申请。专利
本专利技术涉及农学领域。更特别地，本专利技术提供使用定制设计的双链DNA断裂诱导酶在植物基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰，包括插入、缺失或取代的方法和手段。本专利技术还涉及包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含编码具有HPro活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID N0:1的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少IX田间剂量的至少一种HPro抑制剂的耐受性；并且提供制备此类植物的方法。
技术介绍
在植物基因组中引入靶向修饰的需求，例如以向植物提供农学上有用的性状，如除草剂耐受性(包括控制在植物中外源DNA整合的定位)已变得日益重要。为了满足这一需求，已经开发了若干方法(综述参见Kumar (库马尔)和Fladung (弗拉东)，2001, Trendsin Plant Science (《植物科学趋势》)，6，ppl55_159)。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导(DSBI)酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。经由罕见切割内切核酸酶(例如1-SceI)，通过诱导双链DNA断裂(DSB)，激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率(Puchta(普赫塔)等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(美国国家科学院院刊))，93，pp5055-5060 ;Chilton (奇尔顿)和 Que (秋)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，2003 ;D’Halluin (阿吕安)等人，2008Plant Biotechnol.J.(《植物生物技术杂志》)6，93-102)。W096/14408描述了一种编码酶1-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。W000/46386描述了通过1-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。W02005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导(DSBI)酶连同改进的1-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。W02006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。W02008/037436描述了 W02006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。W008/148559描述了 W02008/037436方法的变体，即在真核细胞中(例如植物细胞)中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹，采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。W02003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本专利技术还涉及转基因生物(优选地植物)，包含所述系统或由所述方法产生。 W02006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本专利技术基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。美国临时申请61/493579和EP11004570.5描述了使用双链DNA断裂诱导酶和胚胎发生性愈伤组织以靶定方式修饰棉花植物的基因组的方法和手段。此外，已经描述了这样的方法，其允许设计稀有切割内切核酸酶，以改变酶的底物或序列特异性，因此允许在目的基因座上诱导双链断裂，但不依赖于任何天然稀有切割内切核酸酶的识别位点的存在。简言之，可以使用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然 限制性内切核酸酶，如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合的限制酶。此类方法已经描述于例如W003/080809、W094/18313或W095/09233和Isalan 等，2001，Nature Biotechnologyl9, 656-660 ；Liu 等 1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94, 5525-5530)中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方式描述于W02004/067736中。还可以通过如W02007/047859中描述的合理设计获得具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶。W02007/049095描述了 “LADGLIDADG”归巢内切核酸酶变体，其在两个分开的亚结构域中具有突变，每一个亚结构域结合修饰的DNA靶半位点的不同部分，从而内切核酸酶变体能够切割包含每一个亚结构域结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。W02007/049156和W02007/093836描述了具有新的切割特异性的1-CreI归巢内切核酸酶变体及其用途。W02007/047859描述了合理设计的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的大范围内切核酸酶。WOl 1/064736描述了优化的内切核酸酶，以及使用优化的内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。W011/064750描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域(其包含一个或多个Zn2C6锌指)的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法，并且W011/064751描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。PCT/EP11/002894和PCT/EP11/002895描述了以靶定方式修饰包含嵌合基因的转基因植物的植物基因组的方法和手段，其中所述嵌合基因具有通常用于植物分子生物学中的DNA元件，以及重新设计的大范围内切核酸酶，以切割通常用于植物分子生物学中的该元件。W02009/006297描述了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，其涉及使用双链断裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接(b)植物可表达的启动子和任选地(c)翻译终止和多腺苷酸化区。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K·达伦，J·迪特根，S·简森斯，F·莫伊勒韦特，K·韦特林斯，H·莫泽，T·维尔德，R·海因，U·比克尔斯，L·特落林德尔，G·亨宁格尔，
申请(专利权)人：拜尔作物科学公司，拜尔作物科学股份公司，拜耳作物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE