本发明专利技术公开了一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，该方法对获得新疆雪莲愈伤组织经继代、低大气压力预培养、超低温保存、解冻和再培养，明显提高超低温保存后愈伤组织的复活率。为新疆雪莲的种质保存提供技术依据，可用于新疆雪莲的种质保存。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及植物愈伤组织的保存，具体涉及一种新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)愈伤组织超低温保存的方法,通过低大气压力对新疆雪莲愈伤组织进行预处理，明显提高于愈伤组织超低温保存后组织的复活率，为新疆雪莲种质保存提供技术依据。
技术介绍
新疆雪莲属菊科(Compositae)菜蓟族(Trib.Cynareae Less.)凤毛菊属(Saussurea sp.)多年生草本植物,是一种名贵的高原药用植物。新疆雪莲具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收缩子宫等功能，可治疗妇女小腹冷痛、阳痿、抗衰老及抑制癌细胞增生等作用。新疆雪莲主要分布在海拔2400~4100m的高山冰溃石、流石滩石隙及高山草甸悬崖峭壁上，其生境的土壤极为贫瘠，再加上恶劣的高原环境，其生长速度缓慢，从种子发芽到开花结籽需3至5年时间。因此，野生的新疆雪莲资源非常有限，再加上近年来对雪莲的大规模、无计划的采挖，更是造成了该植物资源的急剧减少。1988年新疆雪莲的资源总量还有2830多万株，而现在可采集量仅为300万株，在《中国珍稀濒危保护植物名录》中，已被列为国家三级渐危物种。另一方面，对野生新疆雪莲的采挖必然造成周围环境和其它植被的破坏。因此，很有必要对现有的原生长地新疆雪莲进行种质资源保护。常规的植物种质资源保存以田间种植、室内贮藏等形式为主，其需要大量的人力和物力等，这使其广泛应用于 种质资源的保存受到了限制。近年来，在离体培养技术基础上发展起来的超低温保存技术，以其无菌培养、保存稳定、占用空间少等优点在植物种质资源的长期保存中受到了人们的重视，得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案:—种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行:步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得:取新疆雪莲种子，用浓度为0.1%的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含a-萘乙酸:2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25°C ±2°C，光照强度为3000LUX、光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代:将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸:2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4%-6%，培养温度250C ±2°C，光照强度为4000LUX，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养；步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养:将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40_60kP的容器中培养4_8天，然后直接作为超低温保存的材料:步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存:将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60%的玻璃化溶液(含有30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)中处理30分钟，再在(TC下无菌转移到100%的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100%的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并立即投入液氮中保存。 步骤五，超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养:从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37°C温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟。将洗涤后的愈伤组织转接到含有a-萘乙酸:2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25V ±2°C，光照强度为4000LUX、光周期16小时。总共培养40天后，在冻存愈伤组织的表面形成新的愈伤组织。根据本专利技术，所述的步骤二中继代培养基中蔗糖的最佳浓度为4% ;步骤三中新疆雪莲愈伤组织低压处理培养容器的最佳的压力值是50kP、最佳处理时间为6天。在此条件下，冻存的新疆雪莲愈伤组织解冻后培养40天其复活率可达到75%，是对照的3.3倍(没有经过低大气压力预培养的材料)。本专利技术的新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，可用于新疆雪莲的种质保存，通过将新疆雪莲愈伤组织在40-60kP大气压力下预培养4-8天，然后再进行超低温保存程序，可明显提高愈伤组织的复活率，为新疆雪莲的种质保存提供技术依据。【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1:1、新疆雪莲愈伤组织的获得取新疆雪莲种子，用浓度为0.1%的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发。将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含2.5mg/L a_萘乙酸和0.5mg/L6-节氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养,培养温度25V ±2°C,光照强度为3000LUX，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；2、新疆雪莲愈伤组织的继代将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸:2.5mg/L、6_苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25°C ±2°C，光照强度为4000Lux、光周期16小时；培养25天后可用于超低温保存；3、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存将新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60%的玻璃化溶液(含有30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)中处理30分钟，再在0°C下无菌转移到100%的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100%的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并投入液氮中保存。4、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37°C温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟。将洗涤后的愈伤组织转接到含有2.5mg/L a-萘乙酸、0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25°C ±2°C，光照强度为4000LUX，光周期16小时。总共培养40天后，愈伤组织的复活率为23%。实施例2:[0031 ] 1、新疆雪莲愈伤组织的获得与实施例1相同；2、新疆雪莲愈伤组织的继代将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸:2.5mg/L、6_苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4%，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养将培养25天的 新疆雪莲愈伤组织转移到40kP的容器中培养4天。4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存与实施例1相同；5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为42%。实施例3:1、新疆雪莲愈伤组织的获得与实施例1相同；2、新疆雪莲愈伤组织的继代将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸:2.5mg/L、6_苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4%，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养将培养25天的新本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行：步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得：取新疆雪莲种子，用浓度为0.1%的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含2.5mg/L a‑萘乙酸和0.5mg/L6‑苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代：将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a‑萘乙酸：2.5mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养；步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养：将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到低大气压力下培养预培养4‑8天，然后直接作为超低温保存的材料；步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存：将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60%的玻璃化溶液中处理30分钟，再在0℃下无菌转移到浓度为100%的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100%的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并投入液氮中保存；步骤五，超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养：从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37℃温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟，将洗涤后的愈伤组织转接到含有a‑萘乙酸：2.5mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时，总共培养40天后，在冻存愈伤组织的表面形成新的愈伤组织。...
【技术特征摘要】
1.一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行: 步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得: 取新疆雪莲种子，用浓度为0.1%的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含2.5mg/L a-萘乙酸和0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养温度25 V ±2°C，光照强度为3000LUX，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织； 步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代: 将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸:2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤:0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25°C ±2°C，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养； 步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养: 将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到低大气压力下培养预培养4-8天，然后直接作为超低温保存的材料； 步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存: 将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60%的玻璃化溶液中处理30分钟，再在0°C下无菌转移到浓度为100%的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100%的玻璃化溶液洗涤，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭斌，尉亚辉，何玮，祁昊楠，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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