一种多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种能够为选育多花黑麦草优良品种提供技术参考的多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法。本发明专利技术采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，再将其转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，通过上述方法建立了高效的多花黑麦草组织培养再生体系，为建立多花黑麦草组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育多花黑麦草组织优良品种提供了技术参考。适合在生物技术领域推广运用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
多花黑麦草是一年生或越年生植物，须根密集细弱，杆多数，直立高50~70厘米。穗状花序扁平。多花黑麦草适口性好，各种家畜均喜采食。多花黑麦草适于刈割青饲，调制优质干草，亦可放牧利用，也是养鱼的好饵料，我国南方各省区多利用鱼塘边旁种植，用以饲喂草鱼。多花黑麦草品质优良，含有丰富的蛋白质，叶丛期由于茎杆少而叶量多，质量更佳。多花黑麦草是重要的一年生或短期多年生禾本科牧草，适于作为大田轮作中的冬春作物。多花黑麦草具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地农业生产中广泛使用的草种。但是，由于田间杂草与多花黑麦草之间进行着强烈竞争，严重影响了多花黑麦草的产量及品质。为了提高多花黑麦草田间除杂效率，降低牧草生产成本，需选育品种优良的多花黑麦草，以提高多花黑麦草的竞争力，但是，迄今尚未见到关于建立多花黑麦草组织培养再生体系及转基因技术相关研究，不能为选育多花黑麦草优良品种提供技术参考。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够为选育多花黑麦草优良品种提供技术参考的多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案为:该多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法，包括以下步骤:A、采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18~22d得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、I~5mg/L的2，4-D和0.5~3mg/L的6-BA组成；B、将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18~22d，所述愈伤组织继代培养基由MS培养基、I~3mg/L的2，4-D和O~0.3mg/L的6-BA组成；C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基中培养18~22d，所述愈伤组织分化培养基由MS培养基、0.5~2mg/L的6-BA组成；D、当幼苗长至2~3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20~30d，所述生根培养基由1/2MS培养基组成；E、当幼苗根系长出后,将其移栽。进一步的是，在步骤A中，对多花黑麦草成熟种子清洗灭菌的处理方式如下所述:首先，将多花黑麦草成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加水和洗涤剂浸泡12小时，所述水与洗涤剂的比例为1:3， 接着再用清水冲走漂浮在液面上的不实种子，然后转移至超净工作台，先将挑选出的种子浸泡在75%的乙醇溶液中I~2min，再转到浓度为0.1%的HgCl2溶液中消毒8min，消毒后用无菌水冲洗集几次并用双层无菌滤纸吸干。进一步的是，所述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、愈伤组织分化培养基中含有的 MS 培养基包括 KNO3> NH4NO3' MgS04.7H20、KH2PO4' CaCl2.2H20、MnSO4.4H20、ZnSO4.7H20、H3BO3' K1、NaMoO4.2H20、CuSO4.5H20、CoCl2.6H20、Na2-EDTA' FeSO4.4H20、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂，各组分的含量如下所述=KNO3S1900mg/L, NH4NO3 为 1650mg/L, MgS04.7H20 为 370mg/L, KH2PO4 为 170mg/L, CaCl2.2H20 为440mg/L, MnSO4.4Η20 为 22.3mg/L, ZnSO4.7Η20 为 8.6mg/L, H3BO3 为 6.2mg/L，KI 为 0.83mg/L，NaMoO4.2Η20 为 0.25mg/L, CuSO4.5Η20 为 0.025mg/L, CoCl2.6Η20 为 0.025mg/L, Na2-EDTA为37.3mg/L, FeSO4.4H20为27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.lmg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L，蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH值为6.0。进一步的是，在步骤A中，所述愈伤组织诱导培养中含有的2，4-D为2mg/L，含有的6-BA 为 lmg/L。进一步的是，在步骤B中，所述愈伤组织继代培养基中含有的2，4-D为2mg/L，含有的 6-BA 为 0.2mg/L。进一步的是，在步骤C中，所述愈伤组织分化培养基中含有的6-BA为lmg/L。进一步的是， 在步骤C中，所述培养条件为培养温度25±2°C、光照强度ΙΟΟΟΙχ。进一步的是，所述生根培养基含有的1/2MS培养基包括KNO3、NH4NO3、MgS04.7Η20、KH2PO4, CaCl2.2H20、MnSO4.4H20、ZnSO4.7Η20、H3BO3> ΚΙ、NaMoO4.2Η20、CuSO4.5Η20、CoCl2.6Η20, Na2-EDTA, FeSO4.4Η20、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼月旨，各组分的含量如下所述=KNO3 为 950mg/L，NH4NO3 为 825mg/L，MgS04.7H20 为 185mg/L，KH2PO4 为 85mg/L, CaCl2.2H20 为 220mg/L, MnSO4.4Η20 为 11.15mg/L, ZnSO4.7H20 为 4.3mg/L，H3BO3 为 3.lmg/L, KI 为 0.415mg/L, NaMoO4.2Η20 为 0.125mg/L, CuSO4.5Η20 为 0.0125mg/L, CoCl2.6H20 为 0.0125mg/L, Na2-EDTA 为 37.3mg/L, FeSO4.4H20 为 27.8mg/L，甘氨酸为2.0mg/L,盐酸硫胺素为0.lmg/L,盐酸吡卩多醇为0.5mg/L,烟酸为0.5mg/L,肌醇为100mg/L,蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH值为6.0。进一步的是，在步骤D中，所述培养条件为培养温度23±2°C，光照强度为800~ΙΟΟΟΙχ，光照时间为每天16小时。本专利技术的有益效果在于:本专利技术采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18~22d得到愈伤组织，由MS培养基、I~5mg/L的2，4-D和0.5~3mg/L的6-BA组成的愈伤组织诱导培养基可以大大提高诱导率，接着将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18~22d，由MS培养基、I~3mg/L的2，4-D和O~0.3mg/L的6-BA组成的愈伤组织继代培养基可以使愈伤组织增殖最快且质量好，再将其转接到愈伤组织分化培养基中培养18~22d，由MS培养基、0.5~2mg/L的6-BA组成的愈伤组织分化培养基可以大大提高分化率，当幼苗长至2~3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20~30d，由1/2MS培养基组成的生根培养基可以大大幼苗的生根率且根系较为健壮，通过上述方法建立了高效的多花黑麦草组织培养再生体系，为建立多花黑麦草组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育多花黑麦草组织优良品种提供了技术参考。【具体实施方式】本专利技术采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18~22d得到愈伤组织，由MS培养基、I~5mg/L的2，4-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：A、采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18～22d得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、1～5mg/L的2,4‑D和0.5～3mg/L的6‑BA组成；B、将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18～22d，所述愈伤组织继代培养基由MS培养基、1～3mg/L的2,4‑D和0～0.3mg/L的6‑BA组成；C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基中培养18～22d，所述愈伤组织分化培养基由MS培养基、0.5～2mg/L的6‑BA组成；D、当幼苗长至2～3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20～30d，所述生根培养基由1/2MS培养基组成；E、当幼苗根系长出后，将其移栽。

【技术特征摘要】
1.一种多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤: A、采用多花黑麦草成熟种子作为外植体，将多花黑麦草成熟种子清洗灭菌后接种到愈伤组织诱导培养基中培养18~22d得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、I~5mg/L 的 2, 4-D 和 0.5 ~3mg/L 的 6-BA 组成； B、将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中培养18~22d，所述愈伤组织继代培养基由MS培养基、I~3mg/L的2，4-D和O~0.3mg/L的6-BA组成； C、将经过步骤B处理的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基中培养18~22d，所述愈伤组织分化培养基由MS培养基、0.5~2mg/L的6-BA组成； D、当幼苗长至2~3cm时，将幼苗接入生根培养基中培养20~30d，所述生根培养基由1/2MS培养基组成； E、当幼苗根系长出后，将其移栽。2.如权利要求1所述的多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法，其特征在于:在步骤A中，对多花黑麦草成熟种子清洗灭菌的处理方式如下所述:首先，将多花黑麦草成熟种子放入瓶中，并在瓶中添加水和洗涤剂浸泡12小时，所述水与洗涤剂的比例为1:3，接着再用清水冲走漂浮在液面上的不实种子，然后转移至超净工作台，先将挑选出的种子浸泡在75%的乙醇溶液中I~2min，再转到浓度为0.1 %的HgCl2溶液中消毒8min，消毒后用无菌水冲洗几次并用双层无菌滤纸吸干。3.如权利要求1所述的多花黑麦草组织培养再生体系的建立方法，其特征在于:所述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、愈伤组织分化培养基中含有的MS培养基包括 KN03、NH4NO3> MgS04.7H20、KH2PO4, CaCl2.2H20、MnSO4.4H20、ZnSO4.7H20、H3BO3, K1、NaMoO4.2H20、CuS04.5H20、CoC12.6H20、Na2_EDTA、FeS04.4H20、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂，各组分的含量如下所述=KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgS04.7Η20 为 370mg/L，KH2PO4 为 170mg/L，CaCl2.2Η20 为 440mg/L，MnS04.4Η20 为 22.3mg/L, ZnSO4.7H20 为 8.6mg/L, H3BO3 为 6.2mg/L, KI 为 0.83mg/L, NaMoO4.2H20 为 0.25mg/L,CuSO4.5H20 为 0.025mg/L, CoCl2.6H20 为 0.025mg/L, Na2-EDTA 为 37.3mg/L,...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春华，刘刚，睢艺芳，余克非，李达旭，孙飞达，刘琳，杨勇，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51