【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光共振能量转移距离分布的测量方法，具体是指一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法。
技术介绍
荧光共振能量转移是一种受激发的供体荧光分子通过偶极子-偶极子长程库伦相互作用将激发态能量转移给邻近基态受体分子的光物理过程。荧光共振能量转移的发生需要供体分子和受体分子之间的距离在1-10nm之间。这个空间尺度正好是活体细胞中各类分子相互作用的线度，因此荧光共振能量转移技术特别适用于细胞内分子互作用以及分子构象变化的研究。 荧光共振能量转移发生时，供体荧光会下降而受体荧光会上升。利用这一点荧光共振能量转移的测量一般分为稳态荧光测量法和荧光寿命测量法两种。稳态荧光测量法包括光谱拟合法和受体漂白法。在供体通道分别测量的对供受体同时存在的样品和供体单独存在的样品分别测量其荧光强度FDA和FD，就可以确定荧光共振能量转移效率E＝1-FDA/FD，或利用供体标准归一化光谱SPD和受体标准归一化光谱SPA可以从供体受体标准归一化光谱SPDA(λ)＝(1-E)*SPD(λ)+E*ΦA*b*SPA(λ)/ΦD中拟合得出转移效率,其中ΦD和ΦA分别为供体和受体的荧光量子产率；b为比例系数在荧光寿命测量法中，转移效率可用受体存在时τDA或不存在时τD的供体荧光寿命来表示：E＝1-τDA/τD。 测量荧光共振能量转移效率的目的在于准确计算供受体距离r。这首先要介
【技术保护点】
一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，该方法包括如下步骤：(1)在单个细胞中分别表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白以及在单个细胞中共同表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白，供体荧光蛋白下述简称为供体，受体荧光蛋白下述简称为受体；(2)利用激光共聚焦扫描显微镜系统的荧光相关谱模块对所述单个细胞进行荧光相关谱测量，获得单独供体的自相关曲线GDd(τ)、单独受体的自相关曲线GAa(τ)、供体受体同时存在的供体自相关曲线GDb(τ)以及供体受体同时存在的受体自相关曲线GAb(τ)；(3)利用自相关函数对步骤(2)中获得单独供体的自相关曲线GDd(τ)进行拟合，计算供体在不同供体波长激光功率下平衡时三线态平均比例和三线态弛豫时间并分别对此供体波长激光功率的对数作图，同样地对单独受体的自相关曲线GAa(τ)进行拟合，获得受体在不同受体波长激光功率下平衡时三线态平均比例和三线态弛豫时间并分别对此受体波长激光功率的对数作图；(4)针对步骤(3)中单独供体在不同激光功率下平衡时三线态平均比例和三线态弛豫时间两条曲线数据，进行联合的列文伯格‑马夸尔特非线性最小二乘法拟合，拟合时参考已知的供体荧光寿命可确定供...
【技术特征摘要】
1.一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，该方法包括如下步
骤：
(1)在单个细胞中分别表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白以及在单个细胞中
共同表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白，供体荧光蛋白下述简称为供体，受体
荧光蛋白下述简称为受体；
(2)利用激光共聚焦扫描显微镜系统的荧光相关谱模块对所述单个细胞进行
荧光相关谱测量，获得单独供体的自相关曲线GDd(τ)、单独受体的自相关曲线
GAa(τ)、供体受体同时存在的供体自相关曲线GDb(τ)以及供体受体同时存在的受
体自相关曲线GAb(τ)；
(3)利用自相关函数对步骤(2)中获得单独供体的自相关曲线GDd(τ)进行拟合，
计算供体在不同供体波长激光功率下平衡时三线态平均比例和三线态弛豫时
间并分别对此供体波长激光功率的对数作图，同样地对单独受体的自相关
曲线GAa(τ)进行拟合，获得受体在不同受体波长激光功率下平衡时三线态平均
比例和三线态弛豫时间并分别对此受体波长激光功率的对数作图；
(4)针对步骤(3)中单独供体在不同激光功率下平衡时三线态平均比例和
三线态弛豫时间两条曲线数据，进行联合的列文伯格-马夸尔特非线性最小二
乘法拟合，拟合时参考已知的供体荧光寿命可确定供体荧光衰减速率 求得供体的系间窜越供体的三线态衰减速率常数以及供体的激发截
\t面 (5)重复第(4)步骤，由已知的受体荧光寿命确定由步骤(3)获得的单独
受体的两条曲线数据受体平衡时三线态平均比重和受体三线态弛豫时间对
同样的两条公式进行联合拟合，求得受体的系间窜越受体的三线态衰减速
率常数 (6)重复第(3)、(4)步骤，利用步骤(2)方案三获得的供体受体同时存在的受体
自相关曲线GAb(τ)数据，获得受体在不同供体激光功率下的平衡时三线态平均
比例和三线态弛豫时间考虑了荧光共振能量转移速率速率常数kFRET之
后，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的kexc参数进行修正；
(7)利用修正之后的公式求取荧光共振能量转移速率常数kET和能量转移效率
E；
(8)任意选取上述步骤(2)不同激光功率的某一激光功率下的受体自相关曲线，
用最大熵算法反演获得受体的三线态权值分布函数 (9)利用步骤(4)、步骤(5)中获得的供体和受体各自的系间窜越、三线态衰减速
率常数以及激发截面在确定供体激发的激光功率下模拟计算不同能量转移
速率常数kET所对应的受体三线态的弛豫特征时间值并用数值作图法表现能
量转移速率常数kET对受体三线态的弛豫特征时间值的函数关系及其反函数的
\t导函数关系 (10)由步骤(7)获得的能量转移速率常数kET对受体三线态的弛豫特征时间值
的函数关系以及导函数关系通过概率分布函数的自由变量之间的
转换，将步骤(8)获得的三线态权值分布函数变换到能量转移速率分布
函数最后变换到供受体距离分布fr(r)，此时得到的是供体受体浓度
在1:1情况下的距离分布情况。
2.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，
其特征在于：所述步骤(2)中对所述单个细胞进行荧光相关谱测量具体采用如下
测量方法：测量时需要进行如下三组测量方案同时进行：方案一、在单独表达供
体的单个细胞采用供体激发波长在不同功率下的激光激发供体，在供体通道进
行荧光光子数计数而获得单独供体的自相关曲线GDd(τ)；方案二、在单独表达受
体的单个细胞采用跟激发供体同样系列的激光功率激发受体，在受体通道进行
荧光光子数计数而获得单独受体的自相关曲线GAa(τ)；方案三、在共同表达供体
和受体的单个细胞采用跟同样系列的激光功率激发供体，在供体通道获得供体
受体同时存在的供体自相关曲线GDb(τ)以及在受体通道获得供体受体同时存在
的受体自相关曲线GAb(τ)，这里τ是指相关时间，上标的大写字母D表示供体通
道的供体荧光信号，上标的大写字母A表示受体通道的受体荧光信号，上标的
小写字母d表示供体单独存在的样品，上标的小写字母a表示受体单独存在的
样品，上标的小写字母b表示供体和受体同时存在的样品。
3.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，
其特征在于：所述步骤(4)中采用如下两个公式进行联合的列文伯格-马夸尔特非
线性最小二乘法拟合：
T ‾ eq = k ISC k exc k exc ( k ISC + k tri ) + k tri k rad ]]> τ tri = ( k tri + k exc k ISC k exc + k rad ) - 1 . ]]> 4.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，
其特征在于：所述步骤(6)中，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的kexc参
数做如下修正：
k exc A , tot ≡ k exc A + k FRET S 1 D ]]> S 1 D = k exc D k T D k exc D ( k ISC D + k T D ) + k dec D , tot k T D ]]> 式中上标D表示供体、A表示受体，表示供体的第一激发态分布随。
5.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，
其特征在于：所述步骤(10)中，能量转移速率分布函数的计算公式如下：
f k ET ( k ET ) = f τ tri ( τ tri ) | dτ tri dk ET | ; ]]> 由能量转移速率分布函数变换到供受体距离分布fr(r)的过程如下：
能量转移速率常数kET到供体受体距离之间有确定函数关系，由福斯特公式
给出：
k ET ( r ) = Q D κ 2 τ D r 6 9000 ln 10 ...
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