本发明专利技术公开了一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株。外切菊粉酶InuAJB13具有以下性质：最适pH5.5，在pH4.0–7.0的范围内维持50%以上的酶活性；经0.1M pH4.0–7.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达90%以上；最适温度55℃，在10–70℃内都具有酶活；0.6–4.5M的NaCl可提高酶活0.2–0.6倍；经0.2–4.5M的NaCl在37℃下处理60min，仍能保持100%以上的活性；在10%（v/v）的乙醇中保持51%的活性；经3.0–15.0%（v/v）的乙醇在37℃下处理60min，仍能保持88%以上的活性；胰蛋白酶、蛋白酶K、表面活性剂、大部分金属离子及市售洗衣液对其活性无影响或影响微弱；可水解菊粉、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、β-2,6-果聚糖（Levan）和可溶性淀粉。本发明专利技术的外切菊粉酶可应用于饲料、食品、洗涤和生物燃料行业。
【技术实现步骤摘要】
耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株
本专利技术涉及基因工程
，具体地说是一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶及其基因、载体、菌株。
技术介绍
菊粉(Inulin)又称为菊糖，是由β _2，I糖苷键连接而成的一种多聚果糖，其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构，主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等双子叶植物体的根部或茎部(Roberfroid et al.JNutr, 2007，137:2493 - 2502)。菊芋俗称洋姜或鬼子姜，具有抗病能力非常强、产量高、耐寒、耐贫瘠、耐干旱、种植简易、适应性强等优点，其块茎的产量很大，可含高达20%鲜重或80%干重的菊粉(Kango et al.FoodBiotechnol, 2011, 25:165 - 212)。菊粉酶具有2种作用方式:一种为外切菊粉酶(Exoinulinase，EC3.2.1.80)，从非还原端逐个水解β_2，I糖苷键，最终生成果糖和少部分的葡萄糖；另一种为内切菊粉酶(Endoinulinase，EC3.2.1.7)，水解菊粉多糖链内部的β-2，I糖苷键，生成低聚果糖(Kango et al.Food Biotechnol, 2011，25:165 - 212)。外切菊粉酶和内切菊粉酶都属于糖苷水解酶第32家族，该家族还包括蔗糖酶、外切β _2，6-果聚糖酶和内切β _2，6-果聚糖酶(Finn et al.Nucleic Acids Res, 2008，36:D281 - D288)。外切菊粉酶水解菊粉并生成果糖及少量葡萄糖，可应用于饲料、食品、洗涤、医药和生物燃料行业，如提高饲料利用率、生产高果糖浆、防治龋齿和生物乙醇发酵(Wankeret al.Appl Environ Microbiol, 1995，61:1953-1958)。耐盐酶在高浓度 NaCl 下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物
(如腌制菊芋的食品改良)，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(Zhou et al.J Ind Microbiol Biot, 2012，39:965 - 975);耐乙醇的酶在同步糖化发酵中可提高乙醇产量和生物质利用率、缩短发酵时间(Sato et al.Journal of BiosciBioeng, 2010，110:679 - 683);耐表面活性剂的酶可应用于洗涤行业(Vi jayalaxmi etal.Appl Biochem Biotechnol, 2013, 171:382 - 395);耐蛋白酶的酶可应用于饲料等多种行业(Zhou et al.J Ind Microbiol Biot, 2012，39:965 - 975)。目前，已报导 I 个耐盐外切菊粉酶(专利申请号:201310275633.9)，该酶为碱性酶，在酸性条件下酶活很低；还尚未报导同时具有耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶。本专利技术的再一目的是提供编码上述外切菊粉酶的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。 本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术所述外切菊粉酶InuAJB13可得自鞘氨醇单胞菌(Sphingobium sp.)。InuAJB13的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。 本专利技术的外切菊粉酶InuAJB13总共含505个氨基酸，理论分子量为55.7kDa，其中N端20个氨基酸为预测信号肽序列“MKRTLAAFIGAGLLASGAQA”，成熟的外切菊粉酶InuAJB13含485个氨基酸。该酶的最适pH值为5.5，在pH4.0-7.0的范围内维持50%以上的酶活性；经0.1ΜρΗ4.0-7.0的缓冲液处理lh，该酶酶活剩余达90%以上；该酶最适温度为55°C，在10 - 700C内都具有酶活；37°C时该酶的半衰期大于60min ；0.6 - 4.5M的NaCl可提高该酶酶活0.2 - 0.6倍；经0.2 - 4.5M的NaCl在37°C下处理60min，仍能保持100%以上的活性；在10% (v/v)的乙醇中保持51%的活性；经3.0 - 15.0% (v/v)的乙醇在37°C下处理60min，仍能保持88%以上的活性；经胰蛋白酶和蛋白酶K在37°C下处理lh，该酶仍能分别保持115.1%和105.7%的酶活；表面活性剂(SDS、Triton X-100、Tween80)、大部分金属离子及市售洗衣液对其活性无影响或影响微弱；在PH5.5及55°C下，该酶对0.5% (w/v)的菊粉、鹿糖、棉籽糖(Raffinose)、水苏糖(Stachyose)、β _2，6_果聚糖(Levan)和可溶性淀粉的比活分别为 73.7±9.3Umg'1655.3±63.5Umg'244.0±8.9Umg'152.6±10.1Umg'27.7±0.2Umg'16.1±1.8Umg_1,而对桦木木聚糖(Birchwood xylan)、山毛榉木聚糖(Beechwood xylan)、4-0-methyl-D-glucurono-D_xylan、阿拉伯木聚糖(Wheat flourarabinoxylan)及 p-nitrophenyl-β -D~xy1pyranoside 均无酶活；该酶可水解洋姜块莖生成果糖。本专利技术提供了编码上述外切菊粉酶InuAJB13的基因inuAJB13，该基因序列如SEQID N0.2 所示。本专利技术通过PCR的方法分离克隆了外切菊粉酶InuAJB13的编码基因inuAJB13，其全长1518bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。该外切菊粉酶InuAJB13全序列与GenBank中Caulobacter sp.AP07来源的糖苷水解酶第32家族蛋白(EJL36942)全序列具有最高的氨基酸序列一致性，为68.3%。该Caulobacter sp.APO7来源的蛋白活性还未研究,只是通过序列相似性判断为糖苷水解酶第32家族的β -果糖苷酶或β -2，6-果聚糖酶或蔗糖酶，所以不能通过该Caulobacter sp.ΑΡ07来源蛋白推导出InuAJB13的活性。此外,本专利技术外切菊粉酶InuAJB13全序列与已报导耐盐外切菊粉酶(专利申请号:201310275633.9)全序列的氨基酸序列一致性为31.8%。以上比对结果和耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的结果说明本专利技术外切菊粉酶InuAJB13是一种新的外切菊粉酶。本专利技术还提供了包含上述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组载体，优选为pEasy-E2-1nuAJB13。将本专利技术的外切菊粉酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术的外切菊粉酶基因基因和表达载体PEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy_E2_inuAJBI3。本专利技术还提供了包含上述外切菊粉酶基因inuAJB13的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶InuAJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种耐盐耐乙醇耐蛋白酶及耐表面活性剂的外切菊粉酶IIU1AJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.一种编码权利要求1所述的外切菊粉酶InuAJB13的外切菊粉酶基因inu...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，周峻沛，张蕊，唐湘华，李俊俊，许波，丁俊美，高雅洁，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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