本发明专利技术公开了一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法，包括如下步骤：一、待测样品处理：将鱼肉与Tris-HCl混合匀浆，过滤，水浴加热，离心，收集上清液为作为测试样品；二、样品检测：将胶体金标记的一抗与测试样品混合均匀得混合液，取5-15μl混合液注入毛细免疫层析管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的液体排出毛细管外，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗，最后通过裸眼定性获得检测结果。本发明专利技术的反方法，检测灵敏度好，重复性高，检测时间快，稳定性好适合用于即时的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种小清蛋白的检测方法，特别涉及一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法。
技术介绍
随着我国经济的快速稳定增长，人民生活质量不断提高，对食物消费的要求也越来越高。但是环境污染、农兽药残留、食物中过敏原等引起的危害食品安全的事件不断见诸报道，已引起人们的广泛关注。20世纪80年代初期，免疫胶体金层析技术以其灵敏度高、特异性强、操作简捷、不需要仪器等特点在医学、环境、食品检测及农牧业等领域广泛应用。胶体金免疫层析方法的核心技术是以条状纤维层析材料为基底通过毛细管作用使金标材料混合物泳动，移动至固定抗原或抗体的区域时，待检物与金标的结合物被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。基于硝酸纤维素膜的高蛋白结合能力和易处理的性质被广泛用作免疫层析的基底材料。然而，硝酸纤维素膜较薄、韧性小且结构复杂，因而在处理过程中易破碎，且易受环境温度和湿度的影响进而影响检测的灵敏度、重复性和贮存寿命(Fu，E.; Liang, T.;Houghtal ing，J.; Ramachandranj S.; Ramsey, S.A.; Lutz, B.; Yager, P.Enhancedsensitivity of lateral flow tests using a two-dimensional paper network format.Anal.Chem.2011，83，7941-7946)。鱼肉中含有丰富的蛋白质和硫胺素、核黄素、尼克酸、维生素D和一定量的钙、磷、铁等矿物质，且鱼肉中脂肪含量低深受消费者的喜爱。但据调查显示，鱼类也是最易引起过敏的八种食物之一。研究发现肌浆蛋白中的小清蛋白，是鱼类的主要过敏原，分子量约为12kDa左右，能引起IgE介导的过敏反应对人体的器官和免疫系统造成严重损伤，对进出口贸易产生较大影响。小清蛋白是一种钙离子结合的酸性蛋白，对热、蛋白酶的水解作用及化学变性都比较稳定，因此灭活和脱除方法的效果不好，建立一种灵敏、可靠、快速的小清蛋白检测方法成为大家关注的焦点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法，灵敏度好，重复性高，检测时间快，稳定性好适合用于即时的快速检测。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是: 一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析检测方法，包括如下步骤: 一、待测样品处理:将鱼肉与Tris-HCl按照1:2-3 (w/v)的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95-100°C下水浴加热5-25min，离心，收集上清液为作为测试样品。本步骤主要目的是从鱼肉中提取纯化小清蛋白，常规的小清蛋白的提取方法一般要经过组织匀浆，抽提步骤，而小清蛋白的纯化过程则非常复杂，经过对粗提蛋白液进行离心，硫酸铵沉淀，透析，离子交换柱洗脱，离心等一系列步骤才能得到较纯的小清蛋白。这样的提取纯化方法较为复杂不适合现场快速检测，因此本专利技术为适应快速检测的需求，改进了小清蛋白的提取纯化方法。二、样品检测:将胶体金标记的一抗与测试样品按1:1-1.5的体积比混合均匀得混合液，取5-15 μ L混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动流经至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，最后通过裸眼定性获得检测结果。作为优选，所述一抗为兔抗小清蛋白。作为优选，所述免疫层析毛细管的组装方法包括如下步骤: (I)毛细管的处理:将毛细管浸入piranha溶液中超声清洗15_20min，超纯水清洗至中性，干燥，冷却，然后将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗10-15min，然后烘干。利用piranha溶液的强氧化性去除毛细管上的有机残留物，同时对毛细管的玻璃表面进行羟基化，使得毛细管的玻璃表面上具有亲水性。将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗，以进一步清洗玻璃表面去除酸、碱和表面的活性基团，同时稳定玻璃表面上的羟基。 (2)毛细管的修饰:将GPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为8V01%-15V01%，三乙胺的终浓度为1V01%-2V01%，将步骤(1)处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应18h-25h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2_3h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗5-7min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗5-7min，氮气气氛下干燥。GPTMS (3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷)含有丰富的环氧基团，通过修饰液处理，将GPTMS的环氧基团固定在毛细管的内壁。排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2-3h，是为了毛细管内壁上固定的基团更稳定，以保证检测时的稳定性。(3)免疫层析毛细管的组装:将作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入步骤(2)处理得到的毛细管的两端，25-30°C下固定1.5-2.5 h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，l-2wt%的BSA溶液注满毛细管，在30-37°C下反应1.5-2h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，重复清洗三次，干燥后获得免疫层析毛细管。作为检测区的抗原是能与胶体金标记的一抗特异性结合的抗原，作为质控区的二抗是能与胶体金标记的一抗特异性结合的抗体。l_2wt9^^BSA溶液注满毛细管，在30_37°C下反应1.5_2h，以封闭毛细管内壁上没有连接蛋白的非特异性位点。玻璃材质具有很多适合作为基底的优点，如廉价、表面均一光滑、无渗透、耐高温、能承受高离子强度漂洗、荧光背景低和样品使用量少等优点。本专利技术针对传统免疫层析材料的不足和玻璃材质自身的优点,利用玻璃毛细管为层析反应器，将胶体金免疫层析检测方法成功转移至毛细管中，建立了一种新型毛细管免疫层析方法。将二抗和抗原固定在特定区域为质控区和检测区，应用直接竞争的方法组装了免疫层析毛细管。作为优选，步骤(I)中的有机溶剂为丙酮或乙醇；Κ0Η溶液浓度为0.8-1.2mol/L,HCl 溶液浓度为 0.8-1.2mol/L。作为优选,步骤(I)中所述piranha溶液的制备方法为:95 wt %_98wt%浓硫酸与30wt%双氧水按照3-4:1的体积比混合，混合时将双氧水溶液缓慢加入浓硫酸中，不断搅拌以保持混合液的温度在80°C以下。作为优选，步骤(2)无水甲苯的制备方法为:甲苯中加入无水硫酸钠静置10_24h，抽滤除去无水硫酸钠，然后加入金属钠丝，同时加入二苯甲酮作为指示剂，加热回流2-3h，然后常压蒸馏，收集111 ± I °C的馏分得无水甲苯。作为优选，无水硫酸钠用量为5-10g/100mL甲苯，金属钠丝用量为0.5-lg/100mL甲苯，二苯甲酮用量为0.1-0.5g/100mL甲苯。作为优选，所述抗原为小清蛋白，二抗为羊抗兔二抗。抗原为小清蛋白，二抗为羊抗兔二抗是针对小清蛋白的检测而设计的，用于与被检测物(小清蛋白)混合的一抗:为保证检测结果的精确和稳定性选用单克隆抗体，可以选择兔抗小清蛋白，鼠抗小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：一、待测样品处理：将鱼肉与Tris‑HCl按照1:2‑3（w/v）的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95‑100℃下水浴加热5‑25min，离心，收集上清液为作为测试样品；二、样品检测：将胶体金标记的一抗与测试样品按1:1‑1.5的体积比混合均匀得混合液，取5‑15μL混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗3‑5min，最后通过裸眼定性获得检测结果。
【技术特征摘要】
1.一种水产品中小清蛋白的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 一、待测样品处理:将鱼肉与TriS-HCl按照1:2-3(w/v)的比例混合匀浆，将匀浆后的样品过滤后，95-100°C下水浴加热5-25min，离心，收集上清液为作为测试样品； 二、样品检测:将胶体金标记的一抗与测试样品按1:1-1.5的体积比混合均匀得混合液，取5-15 μ L混合液注入免疫层析毛细管的检测区端，静置4min后用移液器推动混合液向下移动至免疫层析毛细管的质控区，同样在此区停留4min，将多余的混合液排出免疫层析毛细管，然后免疫层析毛细管浸入在PBST缓冲液中抽动清洗3-5min，最后通过裸眼定性获得检测结果。2.根据权利要求1所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于:所述一抗为兔抗小清蛋白。3.根据权利要求1或2所述的毛细管免疫层析快速检测方法，其特征在于:所述免疫层析毛细管的组装方法包括如下步骤: (1)毛细管的处理:将毛细管浸入Piranha溶液中超声清洗15_20min，超纯水清洗至中性，干燥，冷却，然后将毛细管依次浸入KOH溶液、超纯水、HCl溶液、超纯水及有机溶剂中分别超声清洗10-15min，然后 烘干； (2)毛细管的修饰JfGPTMS和三乙胺溶于无水甲苯中得修饰液，使得GPTMS的终浓度为8V01%-15V01%，三乙胺的终浓度为1V01%-2V01%，将步骤(1)处理所得毛细管浸没于修饰液中室温下干燥环境中反应18h-25h，排出毛细管内的修饰液，室温下干燥环境中保持2_3h，然后将毛细管浸入无水甲苯中上下抽动清洗5-7min，接着将毛细管浸入丙酮中上下抽动清洗5-7min，氮气气氛下干燥； (3)免疫层析毛细管的组装:将作为检测区的抗原和作为质控区的二抗分别注入步骤(2)处理得到的毛细管的两端，25-30°C下固定1.5-2.5 h，将毛细管浸入于PBST缓冲液中抽动...
【专利技术属性】
技术研发人员：林洪，杜淑媛，曹立民，隋建新，王静雪，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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