血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法技术

本发明专利技术公开了血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法。该血管紧张素的制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将血管紧张素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本发明专利技术将反相纯化和反相脱盐联用，设计出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用，可以大批量制备血管紧张素和血管紧张素醋酸盐。

【技术实现步骤摘要】
血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法
本专利技术涉及生物制药领域。更具体地，本专利技术涉及血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法。
技术介绍
血管紧张素(或血管紧张素胺)为增血压药，英文名angiotensinamide或[Asn1，Val5]-angiotensinⅡ，化学结构为L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe，是由八个氨基酸残基组成的合成多肽，理论分子量1031.18。血管紧张素用于外伤或手术后休克和全身麻醉或腰椎麻醉时所致的低血压症等，可预防或治疗围手术期低血压，作为急救用药治疗休克期低血压，也可用于治疗血管紧张素转换酶抑制剂用药过量且常规治疗无效时。鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。醋酸奥曲肽(Octreotideacetate)，是由七个氨基酸残基和一个苏氨醇组成的合成多肽，化学结构为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-N-[2R-羟基-1R-(羟甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺环(2→7)-二硫键醋酸盐，奥曲肽的理论分子量为1019.26，其原料药冻干粉中醋酸含量为5％～12％。醋酸奥曲肽可抑制生长激素，抑制胃肠胰脏分泌多肽等，其制剂临床用于需要长期奥曲肽治疗的活动性肢端肥大症，如术后生长激素残留致血清生长激素水平增高，垂体外照射放射治疗后尚未达到充分疗效的血清生长激素水平升高，部分不适合手术治疗及新诊断生长激素分泌腺瘤患者的术前治疗。目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法，也是我们固相合成血管紧张素纯化和脱盐的主要技术手段。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化工艺。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中多肽盐的制备工艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种多肽、多肽盐的制备方法。本专利技术的多肽盐的制备方法以多肽为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤，制备高纯度的多肽盐、特别是血管紧张素醋酸盐、鞣酸加压素和醋酸奥曲肽的方法。专利技术人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1MNaOH溶液再生，也可以精准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质，其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本专利技术提供了一种多肽的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将多肽粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。其中，所述的多肽粗品可为本领域的各种多肽粗品，较佳地为碱性多肽粗品，更佳地为血管紧张素粗品、加压素粗品或奥曲肽粗品。所述的血管紧张素粗品较佳地为专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血管紧张素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的加压素粗品较佳地为专利申请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的奥曲肽粗品较佳地为采用固相法合成制得的奥曲肽粗品，HPLC纯度为80～90％。所述的多肽粗品溶液较佳地为多肽粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。其中，所述的反相纯化的条件优选如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C为所述的多肽粗品溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；洗脱步骤洗脱时间洗脱液10～2min95％A+5％B22～22min100％C322～40min95％A+5％B440～100min95％A+5％B→65％A+35％B5100～110min40％A+60％B6110～120min95％A+5％B收集保留时间为45～95min的洗脱液得到多肽-三氟乙酸溶液。其中，所述的反相脱盐的条件优选如下：流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1mol/LNaOH溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；洗脱步骤洗脱时间洗脱液10～5min95％A+5％B25～45min75％A+25％多肽-三氟乙酸溶液345～55min95％A+5％B455～75min75％A+5％B+20％C575～95min95％A+5％B695～155min95％A+5％B→65％A+35％B7155～175min40％A+60％B8175～180min95％A+5％B收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到多肽溶液。其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，柱压为650psi。本专利技术还提供了多肽盐的制备方法，其包括下述步骤：将上述制备方法得到的多肽溶液与酸混合，即可。其中，所述的酸较佳地为冰醋酸或鞣酸。本专利技术中，在所述的混合结束后，优选还进行减压浓缩，冷冻干燥，即可得到多肽盐冻干粉体。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0.15～-0.05MPa，所述的减压浓缩的温度较佳地为25～35℃。其中，所述的多肽较佳地为血管紧张素、加压素或奥曲肽。其中，所述的多肽盐较佳地为血管紧张素醋酸盐、加压素鞣酸盐或奥曲肽醋酸盐。血管紧张素、加压素和奥曲肽都是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定，易降解，尤其是强碱环境下，本专利技术综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。本专利技术创新点在于将反相纯化和反相脱盐联用，血管紧张素中含有一个碱性精氨酸残基(其胍基侧链pKa值为12.48)和一个碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管紧张素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将血管紧张素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯‑二乙烯基苯共聚物。

【技术特征摘要】
1.一种血管紧张素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将血管紧张素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物；所述的反相脱盐的条件如下：流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1mol/LNaOH溶液，流速为180～220mL/min，检测波长为220nm；按照下述的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；洗脱步骤洗脱时间洗脱液10～5min95％A+5％B25～45min75％A+25％血管紧张素-三氟乙酸溶液345～55min95％A+5％B455～75min75％A+5％B+20％C575～95min95％A+5％B695～155min95％A+5％B→65％A+35％B7155～175min40％A+60％B8175～180min95％A+5％B收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到血管紧张素溶液。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的血管紧张素粗品为专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血管紧张素粗品，所述的血管紧张素粗品的HPLC纯度为80～90％。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的血管紧张素...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪勇，江锡铭，丁金国，黄臻辉，
申请(专利权)人：上海第一生化药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31