本发明专利技术公开了一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，该菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9092。本发明专利技术还公开了所述菌株在生产丝状真菌蛋白中的应用。实验证实利用本发明专利技术提供的工程菌在表达草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI上，分泌背景低，与用草酸青霉菌株Δ15A表达宿主相比，本发明专利技术的草酸青霉M3QΔ15A宿主表达蛋白量高，运用廉价淀粉作为碳源生产蛋白时，生产成本低，周期短，具有良好的工业开发和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌
本专利技术涉及一种在淀粉上具有低胞外分泌蛋白背景的工程菌株，尤其涉及一种用于提高丝状真菌蛋白表达的宿主菌-草酸青霉菌(Penicillium oxalicum),属于基因工程领域。
技术介绍
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。表达蛋白的宿主即表达蛋白的生物体，可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。异源表达丝状真菌的蛋白尤其是糖苷水解酶类最常用的表达系统有原核蛋白表达系统和毕赤酵母蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密度发酵等优点 。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控，在表达丝状真菌蛋白时过度糖基化现象常见。目前，丝状真菌表达宿主主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株Axyr，因其缺失了一个主要的纤维素酶正调控因子，导致纤维素酶不能被诱导产生并分泌到胞外，从而在葡萄糖上培养时形成了一个低蛋白分泌背景，利于异源表达得到较纯的目标蛋白，但是里氏木霉生长较慢，在PDA培养基上需要约7天才能完成生孢(Uzbas etal.2012.A homologous production system for Trichoderma reesei secreted proteinsin a cellulase-free background.Appl Microbiol Biotechnol 93(4):1601-1608)。由于丝状真菌蛋白的研究需要适合的表达宿主，而目前可供选择的表达宿主又很少，仅有的里氏木霉突变株Axyr生长缓慢，从而限制了很多目标蛋白的表达，进而影响我们对一些蛋白的相关研究以及商业应用，因而构建一个生长快，可利用廉价底物淀粉，且具有低的胞外蛋白分泌背景的表达宿主有着重要的理论和现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，针对丝状真菌蛋白表达尤其是糖苷水解酶表达中存在的上述问题，提供一种能够以较廉价底物淀粉为碳源，快速生长且产生低胞外蛋白分泌背景的用于提高丝状真菌蛋白表达的宿主菌——草酸青霉菌菌株。本专利技术所述的用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于:所述菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,该菌株已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.9092。上述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株在10%的麸皮汁固体培养基上生长约四天完成生孢，孢子颜色比出发株稍浅，在淀粉上生长时胞外分泌少量蛋白。本专利技术所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株的构建方法，步骤是:(I) PGA3持续性激活菌株构建:以pUC_Mpga3为模板，在突变的pga3编码区设计特异引物MG3-F:和MG3-R:进行PCR扩增出核苷酸序列如SEQ ID N0.28所示的突变后的pga3 (具体是将氨基酸序列第208位的谷氨酰氨突变成亮氨酸:Q208L ;也即碱基序列上的CAG突变成CTA);然后从GenBank: KC695878所示全基因克隆pga3基因编码区的下游区，以及筛选标记ptrA基因序列(硫胺吡啶抗性基因)，利用Double-joint PCR方法融合成pga3持续性激活型重组片段，然后通过制备原生质体转化的方法，将pga3持续性激活型重组片段转入到草酸青霉菌株CGMCC N0.5302 ；pga3持续性激活型重组片段两端的同源臂与基因组上的原目的基因Pga3相对应的同源序列发生双交换重组，使突变的pga3基因将本源的基因的编码区置换下来，得到Pga3持续性激活型重组菌株草酸青霉，命名为草酸青霉M3Q，其基因型为:pga3 (P)::pga3Q208L::ptrA ；(2) Amy 15A 基因的敲除:设计带有amyl5A基因序列(GenBank:EPS34453)同源臂的和筛选标记bar (草胺磷抗性基因)的重组片段；然后通过制备原生质体转化的方法，将该amyl5A敲除盒重组片段转入到草酸青霉重组菌株M3Q中，amyl5A敲除盒两端的同源臂与基因组上的目的基因amyl5A相对应的同源序列发生双交换重组，使抗性基因bar将原有的基因的编码区置换下来，得到在草酸青霉M3Q中敲除amyl5A基因同时pga3持续性激活的重组菌株，该菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,其基因型为:Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA0本专利技术所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株在生产丝状真菌蛋白中的应用。其中，上述的应用中优选是将草酸青霉纤维素外切酶CBHI基因在所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A 中过表达获得名为草酸青霉 M3Q Δ 15A-Pamy-CBHI 菌株，以实现高效表达丝状真菌蛋白。其具体方法是:(I)以草酸青霉 CGMCC N0.5302 基因组为模板，克隆 amyl5A(GenBank:EPS34453)编码区上游启动子序列以及cbhl (GenBank:ACV95805)基因的编码区与终止子区，以及筛选标记hph基因序列(潮霉素抗性基因)利用Double-joint PCR方法融合成cbhl过表达盒重组片段，将cbhl过表达盒转入到草酸青霉菌株M3QA 15A以及只敲除amy15A基因的草酸青霉菌株Λ 15Α中，获得转化子CBHI的过表达菌株，命名为草酸青霉M3QA 15A-Pamy-CBHI以及 Δ 15A-Pamy-CBHI,其基因型为(amyl5A(p):: cbhl::hph_ Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)以及(amyl5A (p):: cbhl::hph- Δ amyl5A::bar)。(2)菌种选择:选工程菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A(CGMCCN0.9092) ;M3QA 15A-Pamy-CBHI。 (3)平板培养:将上述工程菌草酸青霉M3QA 15A和M3Q Λ 15A_Pamy-CBHI菌种接种于含有质量百分比为1.5~2.0%的琼脂的固体基本培养基平板上，30°C条件下，静置培养 48h ；(4)种子培养:将步骤⑶培养的菌株，在无菌条件下用接种环接I~2环分生孢子于100毫升并加有2% (质量百分比)葡萄糖为碳源的液体基本培养基中，30°C条件下，150~250转/分钟，pH5.0~5.8，摇床振荡培养16~24小时，制得种子液；(5)产酶培养:以质量体积比为10%的接种量，将步骤(4)的种子液接种于100毫升并加有终本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于：所述菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，该菌株已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9092。
【技术特征摘要】
1.一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于:所述菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,该菌株已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.9092。2.权利要求1所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株的构建方法，步骤是: (1)PGA3持续性激活菌株构建: 以草酸青霉CGMCC N0.5302基因组为模板，从质粒上克隆合成的核苷酸序列如SEQ IDN0.28所示的突变后pga3 ;然后从GenBank:KC695878所示全基因克隆pga3基因编码区的下游区，以及筛选标记PtrA基因序列,利用Double-joint PCR方法融合成pga3持续性激活型重组片段，然后通过制备 原生质体转化的方法，将Pga3持续性激活型重组片段转入到草酸青霉菌株CGMCC N0.5302 ；pga3持续性激活型重组片段两端的同源臂与基因组上的目的基因原来Pga3相对应的同源序列发生双交换重组，使突变的pga3基因将本源的基因的编码区置换下来，得到pga3持续性激活型重组菌株草...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋欣，胡益波，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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