一种适配子及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供了一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.2～11，其分别具有较高的亲和特异性，可以用于KIAA0157蛋白的检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。寡核苷酸序列包括SEQ?ID?No.2～11，其分别具有较高的亲和特异性，可以用于KIAA0157蛋白的检测。【专利说明】一种适配子及其筛选方法和应用
技术介绍
近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是由 SELEX技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)生物文库技术筛选获得的，该技术的原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右。利用单链寡核苷酸分子构像灵活多变的特性，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留以空间构像与靶分子结合的寡核苷酸，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得多种靶分子的特异寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，aptamer比抗体具有更高的特异性，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。而且aptamer的靶分子非常广泛，小至染料分子，大至完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配子。KIAA0157 定位于 10q26.13 (NM_032182.)，mRNA 全长 3008bp，cDNA1248bp，编码 416个氨基酸(序列2)，分子量为47KD的蛋白质。小鼠、大鼠与人的KIAA0157同源性高达90%以上，说明它在进化过程中高度保守，可能发挥着重要的生物学功能。利用生物信息学分析显示，KIAA0157蛋白内部215-266位氨基酸处存在着一个coiled coil结构域，此结构域通常存在于单体蛋白质中，且高度保守，通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。在对抗凋亡蛋白BPE(BRCA复合体亚基4)的相互作用蛋白筛选过程中，KIAA0157被筛选到。该基因及蛋白为全细胞分布，并在多种肿瘤组织中明显下调表达；肝癌病人中KIAA0157在肝癌组织中表达水平高于癌旁组织 。高表达KIAA0157可抑制包括肝癌细胞\肺癌细胞\神经母细胞瘤细胞的生长，并导致细胞发生G0/G1期阻滞。基于以上考虑，本专利技术以KIAA0157蛋白为目的靶蛋白，采用SELEX技术获得了 10条KIAAO157蛋白特异的aptamer，组合应用能够迅速、敏感、特异的检测到KIAAO157蛋白。由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶绑带，因此操作简单、直接。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。所述能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ ID N0.1_10，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对KIAA0157蛋白的识别检测；所述一组能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤:1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；2、将寡核苷酸文库分别与KIAAO157蛋白混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能识别KIAA0157蛋白的寡核苷酸序列。【具体实施方式】实施例1 1、KIAA0157 蛋白的制备采用本领域技术人员熟知的酵母重组表达的方式获得具有与人KIAA0157蛋白相同生物活性的KIAA0157蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白溶液的浓度为IOmg/ml ο2、文库和引物的合成2.1、合成用于筛选的 ssDNA 寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；引物Pl:TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC ；引物P2:CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。2.2、适配子的SELEX筛选，具体方法如下:2.2.1ssDNA与KIAA0157蛋白的结合、分离，具体方法如下:取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文库4μ L，用2X结合缓冲液稀释至100 μ 1，95 °C变性5min,冰浴IOmin后加入100 μ 1ΚΙΑΑ0157蛋白，摇床结合30min,再6000rpm离心5min,弃上清，然后用IX结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L，96°C加热5min,然后15000rpm离心10min,取上清液,对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与KIAA0157蛋白有亲和力的ssDNA次级文库；所述2X结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl,IOmM MgC12、pH7.4。2.2.2ssDNA与KIAA0157蛋白的结合、分离，具体方法如下:将步骤2.2.1分离得到的能与KIAA0157蛋白结合的ssDNA，再与100 μ 1ΚΙΑΑ0157蛋白摇床结合30min，后续步骤同步骤2.2.1，则可分离到与KIAA0157蛋白都有亲和力的ssDNA次级文库。2.2.3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下:对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25 μ I的不对称 PCR 扩增体系为:10XPCR 缓冲液:2μ I ；Ρ1(10μΜ):1μ I ；Ρ2(0.2μΜ):1μ I ；dNTP (各 2.5mM):0.4 μ I ；MgCl2(25mM): 1.2 μ I ;ssDNA 模板(0.2 μ g/μ I):2μ I ；Taq DNA聚合酶(5ιι/μ I):0.2μ I ；ddH20:17.2μ I ;PCR 反应参数:94°C预变性 4min，然后进行 40个循环94°C变性30s，58。。退火30s，72。。延伸20s，最后72°C延伸7min ；2.2.4亲和力的测定，具体方法如下:2.2.4.1扩增:用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；2.2.4.2与蛋白结合:取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μ L，95°本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于适配子筛选的KIAA0157蛋白，其序列为SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：华国光，
申请(专利权)人：华国光，
类型：发明
国别省市：浙江;33