一种毛蚶的含量测定方法技术

本发明专利技术涉及一种毛蚶蛋白多肽及多糖的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中是毛蚶，再测定毛蚶多肽和多糖的含量。毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范围内效果更好。使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种毛蚶蛋白多肽及多糖的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中是毛蚶，再测定毛蚶多肽和多糖的含量。毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范围内效果更好。使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。【专利说明】
本专利技术涉及药品检测方法，具体涉及，属药品
。
技术介绍
毛蚶肉含丰富的蛋白质、维生素及人体所必需的氨基酸，自古就有着食用、药用价值，《医林纂要》注“蚶肉补心血、散瘀血、除烦醒酒、破结消痰”，《日华子本草》注“蚶肉益血色”。近年来，研究报道显示毛蚶有抗肿瘤作用，具有清除体内自由基、提高机体免疫力的功效。毛蚶肉制剂对肺癌、肾癌、胃癌、肝癌等多种癌症具有较好的治疗作用，且安全性良好。根据文献报道毛蚶多肽和多糖是毛蚶的主要生物活性成分，具有保肝、抗肿瘤、调节免疫的功效。暨南大学博士生导师于荣敏教授2011年I月5日报道，新鲜毛蚶去壳，经匀浆、离心、透析、冻干后制得毛蚶多肽提取物，法测定对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及对小鼠NK细胞杀伤活性的影响；对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响；小鼠脾淋巴细胞周期的变化；对主要细胞因子IFN-Y和IL-4分泌水平的影响。结果毛蚶多肽提取物能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红活性和小鼠NK细胞杀伤活性；促进脾淋巴细胞G0/G1期向DNA合成期(s期)转化；协同Con A作用，能够增加IFN-Y的分泌，并且能够抑制IL-4的分泌。中国药科大学窦昌贵等报道，用毛蚶肉水解液小鼠灌胃，结果:对四氯化碳、硫代乙胺和强的松龙引起的血清谷丙转氨酶活性升高均有明显的降低作用，表明毛蚶水解液对实验性肝损伤有显著的保护作用。我们试验发现毛蚶多肽可明显抑制乙肝表面抗原和E抗原的表达，并对乙肝DNA有抑制作用。蛋白质和多糖是生命活动的基本物质，所有动植物生命体都含有这两种基本物质，在无法确定来源的情况下，就不能保证药品的有效性，不能准确测定蛋白质和多糖的含量，就无法在生产和使用中保证产品质量，进而药品疗效得不到保证。现有文献还没有毛蚶多肽和多糖专属性和含量测定的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种毛蚶多肽和多糖的含量测定方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量。，其特征在于先通过凝胶色谱柱高效液相色谱法鉴别样品中的多肽和多糖，如果两项专属性都满足，则确定是毛蚶，再测定毛蚶中多肽和多糖的含量，具体步骤如下: (I)毛蚶多肽鉴别: 色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25°C;流速0.4ml/min ;检测波长280nm ；理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000 ；称取样品IOg,加12倍水超声提取30 min,离心10 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵，O?4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O?4°C条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液； 取毛蚶多肽溶液IOy 1，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；图谱中如果在保留时间15.6min±5%之内有毛蚶多肽的特征峰，其分子量为88070，满足毛蚶多肽专属性，则继续进行以下操作，如无则判为伪品； (2)毛酣多糖鉴别: 色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.lmol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温:40°C ;流速:0.5ml /min ;理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000。称取含毛蚶提取物约2g的样品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5?8，80°C水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心,沉淀加去离子水20ml，80°C水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80°C以下减压干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液，即得。取毛蚶多糖供试品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，测定记录图谱；图谱中如果以图谱中的S峰为参照，呈现2个特征峰，且以S峰为1，2个特征峰的相对保留时间在峰I为0.56±10%、峰2为0.68±10%，其重均分子量(Mw)在6.88?9.47 X IO5之间，满足毛蚶多糖专属性。同时满足毛蚶多肽和多糖的专属性，说明是毛蚶，则继续进行以下操作，如无则判为伪品； (3)毛蚶多肽含量测定:称取样品0.5-2g，加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录IX L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量；我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g。 (4)毛蚶多糖含量测定:称取含毛蚶提取物约l_4g样品，精密称定，置圆底烧瓶中，力口30-50倍水，加热回流1-3小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取l_5ml，加5-10倍乙醇，搅拌，离心5-20分钟，沉淀加水溶解，置20-50量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取l_5ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸5-10ml，摇匀，于30-50°C水浴中保温20-60分钟，取出，置冰水浴中2_10分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算含量。我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H1206)计，不得少于24mg。 毛蚶提取物经真空干燥后的样品蛋白质和多糖含量分别为60%和13%，其中蛋白质含量约是多糖含量的5倍，在毛蚶有效成分研究时，我们发现，小分子量的多肽和多糖为抗肿瘤的主要成分，而大分子量的蛋白生物活性低，药理效果较差。在对毛蚶提取物的研究中，我们经过多次试验发现，毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范围内效果更好。本专利技术的方法测定毛蚶中多肽的含量不仅专属性强，而且提供了毛蚶多肽和多糖的比例，能够保证用毛蚶制备的药品有效和质量可控。为了便于理解本专利技术，特通过下面试验例进一步说明: 一、两批毛蚶提取物片剂样品含量测定 (I)毛蚶多肽鉴别: 色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25°C;流速0.4ml/min ;检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毛蚶的含量测定方法，其特征在于先通过凝胶色谱柱高效液相色谱法鉴别样品中的多肽和多糖，如果两项专属性都满足，则确定是毛蚶，再测定毛蚶中多肽和多糖的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘圣梅，王丽，赵颖，石红艳，刘金磊，
申请(专利权)人：济南康众医药科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37