本发明专利技术涉及基因工程领域，提供了两种马铃薯X病毒超表达载体及一种双分子荧光互补载体的构建方法及应用。通过基因重组的方式，将马铃薯X病毒1985分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得的侵染性克隆通过农杆菌浸润可侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物。对侵染性克隆进行改造，获得了可在寄主植物体内高效表达1种或2种外源蛋白的超表达载体，以及能鉴定蛋白互作的双分子荧光互补载体。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及基因工程领域，提供了两种马铃薯X病毒超表达载体及一种双分子荧光互补载体的构建方法及应用。通过基因重组的方式，将马铃薯X病毒1985分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得的侵染性克隆通过农杆菌浸润可侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物。对侵染性克隆进行改造，获得了可在寄主植物体内高效表达1种或2种外源蛋白的超表达载体，以及能鉴定蛋白互作的双分子荧光互补载体。【专利说明】马铃薯X病毒超表达及双分子荧光互补载体的构建方法及应用
本 专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及马铃薯X病毒属的马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX) 1985分离物侵染性克隆、超表达载体及双分子荧光互补载体的构建方法及应用。
技术介绍
侵染性克隆是研究植物病毒基因组功能的重要工具。利用病毒的侵染性克隆，也可以构建过量表达载体。与转基因技术相比，利用超表达载体在植物体内表达外源蛋白的技术具有操作简单、成本低、生产周期短、表达量高等优点。双分子突光互补(Bimolecularfluorescence complementation, BiFC)试验是鉴定蛋白互作的重要方法。其主要原理是编码黄色荧光蛋白(YFP)的N和C段)的基因片段分别与编码诱饵蛋白和捕获蛋白的基因融合，通过农杆菌浸润植物叶片，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。这种方法具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以检测到，但要求携带融合蛋白基因的农杆菌必须要进入同一个细胞才能检测到。马铃薯X病毒(PVX)属于马铃薯X病毒属(Potexvirus),主要侵染烟草、番爺、马铃薯等茄科作物，在作物上部叶片产生轻花叶，是这些作物上的主要病毒之一。PVX与马铃薯Y病毒属病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，导致更大损失。PVX曾经被改造成瞬时表达载体(如PGR106等)，并被广泛应用。但pGR106等载体只能表达一种蛋白。本专利技术研制的两种超表达载体，一种可以同时表达两种蛋白，另一种能够瞬时超量表达外源蛋白，还进一步研制了能在活体中鉴定两种蛋白互作的载体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法及应用，通过基因插入重组的方式，将马铃薯X病毒1985分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得了侵染性克隆pCaPVXIOO。在此基础上，将pCaPVXIOO改造成了三种载体:(I)能同时表达两种蛋白的超表达载体pCaPVX440。利用该载体，可根据需要在植物细胞内同时表达两种蛋白。(2)能用来鉴定互作蛋白的载体pCaPVX770。编码诱饵蛋白和捕获蛋白的基因分别克隆到PVX载体的两个不同多克隆位点，它们分别与YFP的N和C端融合表达。该载体保证两个候选蛋白能同时进入一个细胞，提高了鉴定互作蛋白的效率。(3)基于基因替换策略的瞬时表达载体pCaPVX760。该载体通过农杆菌浸润的方法接种，操作简单成本低，并且能显著提高外源蛋白的表达量，短时间内能够获得大量重组外源蛋白。本专利技术实施的具体技术方案是:马铃薯X病毒侵染性克隆的构建，具体步骤如下:a.从马铃薯X病毒侵染的烟草中提取总RNA ;可采用常规提取方法获得。b.以Oligo dT为引物反转录，分三段对马铃薯X病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法将35S启动子融合到马铃薯X病毒基因组的5^ -末端前。c.用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCaPVXIOOοd.改造pCaPVXIOO，在其TGB和CP基因间插入PVX CP启动子和酶切位点、TMV CP启动子和酶切位点，获得了超表达载体pCaPVX440。e.将编码YFP N 一端和C 一端的基因分别克隆到pCaPVX440的两个酶切位点之后，获得了检测两种蛋白互作的BiFC载体pCaPVX770。f.改造pCaPVX440，将CP基因替换为多克隆位点，获得了瞬时表达载体pCaPVX760og.将c、d、e、f中构建的载体通过农杆菌浸润接种寄主植物。h.观察症状及检测。采用本专利技术所述的技术方案，可以获得如下的技术效果:I)侵染性克隆 pCaPVXIOO可用农杆菌浸润接种，能稳定侵染马铃薯、烟草和番茄等植物。2)利用超表达载体pCaPVX440可在植物中同时表达两种外源蛋白。3)利用载体pCaPVX770可鉴定两种蛋白能否互作。4)利用载体pCaPVX760可在短时间内获得大量的外源蛋白。【专利附图】【附图说明】图1为PVX超表达和BiFC载体基因组结构示意图图2为pCaPVXIOO在不同寄主上的症状(上)及PCR检测结果(下)图3为利用pCaPVX440同时表达GFP和YFP图4为利用pCaPVX760超表达GFP的情况图5为pCaPVX770作为BiFC载体的应用I和3分别为含有pCaPVX770_22和pCaPVX770_20的农杆菌浸润的植株系统叶片，I中许多细胞中有黄色荧光，而3中细胞内没有黄色荧光；2为用传统BiFC方法的结果，只能在个别细胞内观察到荧光。【具体实施方式】以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。本专利技术所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表:【权利要求】1.一种马铃薯X病毒的侵染性克隆构建方法，其序列如Seq ID No:31所示。2.权利要求1所述的载体，其特征在于可通过以下步骤获得: (1)在马铃薯X病毒侵染的烟草中提取植物总RNA，以OligodT为引物进行反转录，设计引物分三段对马铃薯X病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法分别将35S启动子融合到马铃薯X病毒的5'末端。 (2)用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCaPVXIOO。3.如权利要求1所述载体，在其TGB和CP之间插入TMVCP启动子和克隆位点AsiSI，PVX CP启动子和多克隆位点(Sac1、BstB1、MluI)，获得了超表达载体pCaPVX440。4.如权利要求3所述载体，将TGB替换为TMVCP启动子+多克隆位点(Sac1、BstB1、MluI) +编码HA及YFP N-端的基因，将CP替换为多克隆位点(AsiS1、XhoI) +编码myc及YFP C-端的基因，获得了双分子荧光互补载体pCaPVX770。5.如权利要求3所述载体，将其CP替换为多克隆位点(Nhe1、Nru1、XhoI)，获得了瞬时超表达载体pCaPVX760。6.如权利要求3、4所述载体在表达外源蛋白方面的应用。7.如权利要求5所述载体在鉴定蛋白互作方面的应用。【文档编号】G01N33/68GK103966256SQ201310432793【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日 【专利技术者】李向东, 王莹, 丛倩倩 申请人:山东农业大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种马铃薯X病毒的侵染性克隆构建方法，其序列如Seq ID No:31所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，王莹，丛倩倩，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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