一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，该方法首先用微乳法制备纳米铝佐剂：将等比例的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后加入适量的AlCl3溶液搅拌。缓慢滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，然后加入丙酮破乳离心，沉淀物离心洗涤三次，将离心后的沉淀干燥箱中干燥过夜，即得到蓬松的纳米Al(OH)3佐剂。然后将H22肝癌细胞悬液与纳米铝佐剂共孵育，得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。本发明专利技术制得的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗粒径小、分散性好、具有较好的稳定性，有良好的生物相容性。动物实验结果显示：纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗抗肿瘤作用明显优于普通铝佐剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗肿瘤的自体疫苗领域，涉及一种作为治疗癌症的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗及其制备方法。
技术介绍
迄今为止,肿瘤仍是威胁人类健康与生命的顽症。肿瘤的生物治疗作为治疗的新模式，已经成为肿瘤综合治疗中不可取代的重要组成部分，它主要包括免疫治疗和基因治疗两方面。肿瘤免疫治疗的目的是激发和调动免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。从目前国际研究的趋势分析，从实际应用的角度推测，免疫治疗将会有广泛的研究前景。而免疫治疗的研究上又包括对疫苗的研制和新型免疫佐剂的开发。肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原类物质诱导机体产生针对肿瘤细胞的免疫反应，抑制其生长，防止其复发和转移。研制肿瘤疫苗所面临的最大问题就是如何使人体对肿瘤产生有效的免疫应答。T细胞介导以细胞免疫为主的免疫应答在机体抗肿瘤免疫起重要作用。T细胞的激活需双重信号，T细胞受体与抗原结合后，提供第一信号，共刺激因子B7等为第二信号。CD8+CTL细胞在Th细胞辅助下活化后除直接杀伤肿瘤细胞，还分泌淋巴因子如Y-干扰素、淋巴毒素间接杀伤瘤细胞。CD4+T细胞激活可分泌细胞因子如IL-2等，该类因子在CD8+CTL激活过程中起辅助作用。另外，NK、巨噬细胞等也可杀伤瘤细胞，体液免疫仅起辅助作用。 100多年前，Wiliam Coleys首次使用脓球菌抽提物刺激机体,可产生抗肿瘤的免疫应答，成为第一例有报道的肿瘤疫苗。在肿瘤免疫中，利用肿瘤细胞特异的细胞毒T淋巴细胞只杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞，利用机体免疫机制消灭肿瘤细胞是人们多年的梦想。随着人们对肿瘤的免疫机制深入认识，瘤苗的发展极为迅速，出现了细胞疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗、癌基因与抑癌基因疫苗及亚单位疫苗等。根据疫苗的来源不同，肿瘤疫苗可分为以下四种:(I)活疫苗:自体或异体的瘤细胞制成；(2)灭活疫苗:瘤细胞经射线照射，抗癌药，冻融等处理，抑制其生长能力，保留其抗原性；(3)修饰或改变的瘤细胞:用蛋白佐剂、病毒佐剂、细菌佐剂、化学佐剂等处理，使肿瘤细胞的免疫原性增强，或肿瘤细胞转染基因，细胞融合等，改变了肿瘤的免疫原性；(4)亚细胞成份疫苗:用各种方法破坏的自体或异体肿瘤细胞，分离其细胞膜成分及提纯细胞膜表面可溶细胞表面肿瘤抗原。上述疫苗各有其优缺点，活疫苗虽抗原性较强，但毒副作用也很强；多肽疫苗具有安全性好、容易获得、纯度高的特点，曾被认为是最有希望的瘤苗，但所在的缺点是不可回避的，一是合成多肽的直链结构，在整个功能上可能与天然分子不完全相同；二是合成多肽的半衰期短，在体内一般只有数分钟，蛋白酶可将其迅速降解；更为关键的还因为表位多肽分子小，免疫原性较弱，难以刺激甚至根本不能刺激产生有效的免疫应答；再者，合成的多肽在APC细胞膜表面与MHC-1I或MHC-1类分子的结合效率比在溶酶体中要低得多，最重要的原因在于肿瘤细胞潜在表达多种肿瘤抗原，针对某个或某些表位产生的免疫应答不能有效的抑制肿瘤细胞的生长。实践证明，其并不一定能激发机体的抗瘤免疫应答。而细胞疫苗可表达多种肿瘤抗原，同时与异体全肿瘤细胞疫苗相比，自体全肿瘤细胞疫苗(autologous tumor vaccine,ATV)拥有个体特异完整的肿瘤抗原和HLA分子，比异体肿瘤细胞疫苗安全、有效。自体肿瘤细胞的免疫原性弱，常常在制备自体肿瘤细胞疫苗时添加免疫佐剂，因此在细胞瘤苗免疫学治疗中佐剂是最重要的成分。自从Ranmon发现一些与免疫原无关的物质可以增强类毒素或白喉毒素的抗原性以来，佐剂被用来增强机体对抗原的免疫力已经70多年了。佐剂是一类先于抗原或与抗原混合后注入机体，在广义上可通过特异性或非特异性免疫增强作用提高血清中疫苗抗原特异性抗体水平的物质。可溶性纯化蛋白质疫苗或蛋白质亚单位疫苗的免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体，因此通常在疫苗制剂中加入佐剂。与单独应用抗原相比，抗原与佐剂吸附应用所需的抗原量较少，机体产生的抗体量较多，并且还可以减轻免疫耐受。佐剂可以通过很多方式来增强机体对疫苗的反应:可增强弱抗原的抗原性；可增强免疫反应的持续时间和速度；可调控抗原的效价、特异性、同型或分化；可刺激细胞免疫应答；可增强和诱导粘膜免疫反应；可增强免疫系统未成熟或衰老的个体的免疫力；可减少抗原的剂量或降低抗原的成本，也可帮助克服联合疫苗中的抗原竞争。近来，Edelman对佐剂进行了细致分类:①矿物质盐，例如氢氧化铝、磷酸钙等；②表面活性物质及其微粒类，例如ISC0M、Ty类病毒颗粒等；③细菌或病毒产物，例如肺炎克雷伯杆菌糖蛋白、海藻糖结核环脂酸盐等，以及具有载体功能的白喉类毒素、B型脑膜炎球菌外膜蛋白等细胞因子，例如α或￥-干扰素、61^3?、11^-1、11^-2等；?激素，例如1，25-二羟维生素03、人生长激素等独特抗原构架，例如N-端软脂酰化CTL抗原决定簇与Th细胞抗原决定簇的结合物等多阴离子物质，例如右旋糖苷；⑧多聚丙烯酸衍生物，例如丙烯酸与烯丙基蔗糖交联物等活病原微生物，例如啤酒酵母、减毒伤寒杆菌、戈登氏链球菌等；⑩佐剂制剂，例如弗氏不完全佐剂、MF-59、脂质体等。其中纳米颗粒为新一类型重要的佐剂，可以将抗原定向运输至肿瘤生成部位 ，控制抗原的释放，从而延长抗原释放时间，延长抗癌作用，减少肿瘤生长，延长荷瘤动物的存活时间。纳米粒子是指直径一般在I~1000nm之间的聚合物形成的微粒，它具有独特的小尺寸效应和界面效应。抗原物质或能编码免疫原多肽的DNA或RNA可被包裹于纳米粒子内部或是吸附在纳米粒子表面，也可通过化学连接作用与纳米粒子结合，纳米粒子佐剂可有效增强细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。纳米佐剂的作用包括:可增强抗原的免疫原性，极大减少抗原用量；增强细胞免疫和体液免疫；形成抗原储库作用并实现疫苗的控释；辅助抗原诱导机体特异的粘膜免疫。QingHe等用磷酸钙纳米粒子加2型单纯疱疹病毒蛋白(CAP+HSV-2)，CAP磷酸盐缓冲溶液(PBS)，2型单纯疱疹病毒蛋白(HSV-2)分别对雌性BALB/C小鼠进行阴道内或鼻腔内免疫接种。结果表明CAP+HSV-2诱导产生特异性的黏膜免疫球蛋白IgA和IgG，同时提高全身IgG水平，而且在小鼠血清中发现了中和抗体。在首次接种后第45天，以2型单纯疱疹病毒攻击小鼠，试验结果显示用CAP+做佐剂副反应轻微，能引起Thl型反应，产生很高滴度的IgG2a抗体，因而认为它在不久的将来可取代铝盐佐剂应用于人体。钟石根等将钙纳米粒子与NP30制备成Ca-NP30结合物，主动免疫BALB/c小鼠，观察其对小鼠受血吸虫攻击的保护性作用。结果表明钙纳米粒子可增强NP30对宿主的保护性作用，减虫率明显提高，从单用NP30的30.4%提高到57.8% ;血清特异性抗体IgG水平比对照组显著升高；足垫实验可引发迟发型过敏反应。此项研究表明:钙纳米粒子可作为血吸虫抗独特型抗体NP30疫苗的佐剂，其作用机制与同时引起体液免疫和细胞免疫应答增强有关。何萍等用纳米铝佐剂物理吸附HbsAg，以常规铝佐剂为对照，分别免疫小鼠和豚鼠，发现纳米铝佐剂对小鼠和豚鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答都比常规铝佐剂强。纳米疫苗佐剂具有很多的优点。综上所述:可以增强疫苗免疫原性和抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）制备纳米铝佐剂：按质量比1:1:1将苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速混合后搅拌均匀，得到的混合溶液置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl3质量比1:1.3~1.5，将后者加入所述混合溶液中搅拌20min以上，然后按20~30滴/min的速度向混合溶液中滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，得到乳浊液；向所述乳浊液中加入丙酮，至乳浊液变清，以>500rpm的速度离心，弃去上清液，得到沉淀物；最后将沉淀物先后用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次后，置于干燥箱中干燥，即得到纳米铝佐剂；2）制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗：将H22肝癌细胞悬液与浓度为2~4mg/ml的纳米铝佐剂4℃共孵育7天，即得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 1)制备纳米招佐剂: 按质量比1:1:1将苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速混合后搅拌均匀，得到的混合溶液置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl3质量比1: 1.3^1.5，将后者加入所述混合溶液中搅拌20min以上，然后按20-30滴/min的速度向混合溶液中滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，得到乳浊液； 向所述乳浊液中加入丙酮，至乳浊液变清，以>500rpm的速度离心，弃去上清液，得到沉淀物；最后将沉淀物先后用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次后，置于干燥箱中干燥，即得到纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：张东生，刘慧，杜益群，张皓，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32