包含4-羟基苯甲酰基-COA硫酯酶的遗传改造的微生物以及使用其的方法技术

本发明专利技术提供表达4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的包括光合微生物在内的遗传改造的微生物以及使用所述遗传改造的微生物产生游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含4-羟基苯甲酰基-COA硫酯酶的遗传改造的微生物以及使用其的方法相关串请案交叉参考本申请案主张优先于2010年12月23日申请的具有相同标题的美国临时专利申请案第61/426，568号的权益，所述申请案全文以引用方式并入本文中。序列表参考本申请案含有对氨基酸序列和/或核酸序列的参考，其作为标题为“2010EM383 (PM0010) sequences.TXT”的序列表文本文件与本文同时提交，文件大小为71.1千字节(KB)，于2011年12月12日创建。依照37C.F.R.§ 1.52(e) (5)将上文所提到的序列表全文以引用方式并入本文中。
本专利技术涉及用于在微生物(包括光合微生物，例如蓝细菌和微藻)中产生游离脂肪酸和脂肪酸衍生物的组合物和方法。
技术介绍
牛物燃料生物燃料代表 来自活生物体(例如高等植物、真菌和细菌)的可再生能源。光合生命形式捕捉光能且随后使用水作为最终电子供体将其转化为基于固定CO2的有机化合物的自由能。目前，采用两种主要技术使用光养性生物体来生成生物燃料:第一种技术，通过将植物糖内含物发酵为乙醇来生产基于植物的生物燃料；及采用程度显著较低的第二种技术，通过从大规模培养的生物质提取脂质来生产源自藻类的生物柴油(安格迈尔(Angermayr)等人，2009,生物技术新见(Curr Opin Biotechnol), 20 (3):257-263)。MM生物脂质是一类化学上多变的化合物，其共同的定义性特征是其不溶于水。脂质的生物功能同样多变。在多种生物体中，脂肪和油是主要储能形式，且磷脂和留醇大约占生物膜物质的一半。其它脂质尽管以相对较少量存在，但仍作为以下成份发挥关键作用:酶辅因子、电子载体、光吸收色素、疏水锚、乳化剂、激素和细胞内信使(罗迪士，H.(Lodish,H.),分子细胞生物学(Molecular Cell Biology),第6版,圣马丁出版社(St.Martin' sPress) (2008))。脂肪酸脂肪酸是具有4到36个碳的烃链的羧酸。在一些脂肪酸中，此链完全饱和(意味着其不含双键)且无分支；其它脂肪酸含有一个(单不饱和)或一个以上双键(多不饱和)。少数脂肪酸含有三碳环或羟基。这些化合物的简称详细说明链长度和双键数，通过冒号隔开；16碳饱和棕榈酸简写为16: 0，且具有一个双键的18碳油酸是18: I。任一双键的位置通过Λ (delta)后的上标数字来详细说明；例如，在C-9与C_10(C_1是羧基碳)之间具有一个双键且在C-12与C-13之间具有另一个双键的20碳脂肪酸命名为20: 2(Λ9’12)。最常见脂肪酸在12到24个碳的无分支链中具有偶数个碳原子。偶数个碳源自这些化合物的合成模式，其涉及乙酸(二碳)单元的缩合。(伦宁格(Lehninger)等人,生物化学原理(Principles of Biochemistry),第 I 卷，麦克米伦(Macmillan), 2005)。双键在不饱和脂肪酸中的位置也是不规律的；在大多数单不饱和脂肪酸中，双键介于C-9与C-1O之间(Λ9)，且多不饱和脂肪酸的其它双键一般为Λ 12和Λ15。多不饱和脂肪酸的双键几乎从不共轭(交替的单键和双键)，但一般通过亚甲基隔开(-CH = CH-CH2-CH=CH-)。脂肪酸和含有它们的化合物的物理性质主要取决于烃链的长度和其不饱和程度，即脂肪酰基链越长且双键越少，在水中的溶解度越低。(伦宁格等人，生物化学原理，第I卷，麦克米伦，2005)。脂肪酸生物合成乙酰-Cok羧化酶催化从乙酰-Cok不可逆地形成丙二酰-Coh,这被认为是脂肪酸生物合成中的第一个关键步骤(图1)。乙酰-CoA羧化酶含有生物素作为其辅基，所述生物素通过酰胺键联共价键结到酶分子三个亚单元中的一个亚单元上的赖氨酸残基的ε-氨基。首先在ATP依赖性反应中将源自碳酸氢根(HCCV)的羧基转移到生物素。生物素基团用作CO2的临时载体，在第二步骤 中将其转移到乙酰-CoA以产生丙二酰-CoA。(伦宁格等人，生物化学原理，第I卷，麦克米伦，2005)。与必须将培养基中的葡萄糖代谢为乙酰-CoA以起始脂肪酸合成的其它异养细菌(例如大肠杆菌(E.coli)相反，在蓝细菌中，用于脂肪酸合成的前驱物(即乙酰-CoA)直接源自卡尔文-本森(Calvin-Benson)循环,所述循环使用光合作用的光反应提供的能量和还原力来固定二氧化碳。装配脂肪酸中碳原子长链的反应序列由以下四个步骤组成:(I)缩合；(2)还原；(3)脱水；和(4)还原。使在此系列反应期间产生的饱和酰基再循环以成为与丙二酰基的另一缩合中的底物。每进行一次循环，脂肪酰基链延长两个碳。在多种细胞中，链延长在链达到16个碳时结束，且产物(棕榈酸根，16: O)离开循环。乙酰基的甲基和羧基碳原子分别成为棕榈酸根的C-16和C-15 ;其余碳原子源自丙二酰-CoA。合成过程中的所有反应都是通过多酶复合物(脂肪酸合酶)催化(伦宁格等人，生物化学原理，第I卷，麦克米伦，2005)。脂肪酸合成中的延长循环脂肪酸合成代表关键保守过程，通过所述过程产生酰基链用于多种终产物，例如生物膜。催化从乙酰CoA、丙二酰-CoA和NADPH合成饱和长链脂肪酸的酶系统称为脂肪酸合酶(FAS)(图1)。可将脂肪酸合酶(FAS)分为两类(I型和II型)，其分别主要存于真核生物中以及存于细菌和植物中。其特征在于由大型多功能多肽组成(在I型情形中)或由分散表达的单功能蛋白质组成(在II型系统中)。(陈D.(Chan D.)和沃格尔H(VogelH)，生物化学杂志(Biochem J.)，2010，430 (I):1_19)。脂肪酸合酶含有6种催化活性且含有β -酮酰基合酶(KS)、乙酰/丙二酰酰基转移酶(ΑΤ/ΜΤ)、β -羟基酰基脱水酶(DH)、烯酰基还原酶(ER)、β-酮酰基还原酶(KR)、酰基载体蛋白(ACP)和硫酯酶(TE)(吉罗拉(Chirala)和瓦克尔(Wakil)，脂质(Lipids)，2004，39 (11):1045-53)。已显示，在高等生物中导致脂肪酸合成的反应与细菌中的那些反应非常相似(伯格(Berg)等人，生物化学(Biochemistry),第 6 版,麦克米伦，2008)。脂肪酸生物合成是通过脂肪酸合酶组份酶乙酰基转移酶来起始，所述酶将来自辅酶A(CoA)的酰基引物(通常是乙酸根)加载到脂肪酸合酶(FAS)上的特定结合位点。在所述过程结束时，通过转酯到适宜受体或通过水解将产物从脂肪酸合酶(FAS)移除来结束链延长。各别酶通常为棕榈酰基转移酶和硫酯酶。介于起始与终止之间的反应序列涉及通过一组独特反应步骤的若干次反复循环来延长酶结合中间体。每一循环包括(i)通过丙二酰转移酶将丙二酰从CoA转酰基到酶；(ii)通过3-酮酰基合酶将酰基-酶与酶结合丙二酸缩合为3-酮酰基-酶，(iii)通过酮酰基还原酶将3-酮基-还原为3-羟基酰基中间体，(iv)通过脱水酶使3-羟基酰基酶脱水为2，3-反式-烯酸，和(V)最后，通过烯酰基还原酶将烯酸还原为饱和酰基-酶。辅基4’ -磷酸泛酰巯基乙胺在底物结合、中间体处理和中间体在脂肪酸合酶(FAS)之各个催化中心之间之沟通中具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物，其包含编码4‑羟基苯甲酰基‑CoA硫酯酶的重组核酸分子，其中所述4‑羟基苯甲酰基‑CoA硫酯酶在所述微生物中的表达使得产生至少一种游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.12.23 US 61/426,5681.一种微生物，其包含编码4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的重组核酸分子，其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶在所述微生物中的表达使得产生至少一种游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶水解所述微生物中的酰基-ACP。3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述至少一种脂肪酸衍生物包含至少一种脂肪醛、至少一种脂肪醇、至少一种蜡酯、至少一种烷烃、至少一种烯烃或其组合。4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述至少一种脂肪酸衍生物的总碳数为7到36。5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物能产生至少一种酰基链长度为8到24个碳的脂肪酸。6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物能产生至少一种酰基链长度为8到18个碳的脂肪酸。7.根据权利要求1所述的微生物，其中至少30重量％的由所述微生物产生的所述游离脂肪酸是酰基链长度为8个碳、10个碳、12个碳、14个碳、16个碳、18个碳的游离脂肪酸或其任一混合物。8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶是原核酶且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70%氨基酸序列一致性。9.根据权利要求1所述的微生物，其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶包含与SEQIDNO:1或SEQ ID NO:2具有至少70% —致性的氨基酸序列。10.根据权利要求1所述的微生物，其中编码所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的所述核酸分子包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。11.根据权利要求1所述的微生物，其中编码所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的所述核酸分子被稳定整合到所述微生物的染色体中。12.根据权利要求1所述的微生物，其中编码所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的所述核酸分子位于表达构筑体中。13.根据权利要求12所述的微生物，其中所述表达构筑体包含可操作地连接到编码所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的所述核酸分子的启动子，且其中所述启动子在所述微生物中发?车功能。14.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物进一步包含至少一种编码至少一种额外多肽的额外核酸分子，其中所述额外核酸分子在所述微生物中的表达促进产生游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。15.根据权利要求14所述的微生物，其中所述至少一种额外核酸分子编码乙酰-CoA羧化酶或β -酮酰基合酶KAS。16.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物具有减弱的至少一种编码包含酰基-酰基载体蛋白ACP合酶、酰基-CoA脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、乙醛-CoA脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶和其组合的蛋白质的基因的表达。17.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是光合微生物。18.根据权利要求17所述的光合微生物，其中所述光合微生物是微藻或蓝细菌。19.一种用于在培养物中产生游离脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法，所述方法包含在生长培养基中培养微生物， 其中所述微生物包含至少一种编码4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的重组核酸分子； 其中所述微生物是在容许在培养阶段期间在所述微生物中表达所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶的条件下生长；且 其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶在所述微生物中的表达使得产生至少一种游离脂肪酸和/或至少一种脂肪酸衍生物。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述4-羟基苯甲酰基-CoA硫酯酶水解...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·克里斯托弗·布朗，瑞卡·谢沙德利，卡洛斯·查韦斯托雷斯，徐卫东，托比·理查德森，
申请(专利权)人：艾克森美孚研究与工程公司，
类型：发明
国别省市：美国;US